曲古抑菌素A促進去卵巢大鼠鈦植入物骨整合

周志 蔣文凱 劉之義 李楊 任茂賢 劉合棟 楊民

皖南醫學院弋磯山醫院創傷骨科,安徽 蕪湖 241001

隨著人口老齡化進展,骨質疏松性骨折已經成為世界性健康難題[1-3]。鈦合金因為其穩定的理化性質及良好的生物相容性等優點,被廣泛應用于骨科植入。然而,鈦植入物(titanium implants, TI)松動仍然是困擾骨科醫生的一大挑戰[4-5]。骨整合(osseointegration)是指植入物與周圍骨組織直接接觸,連接成為一個穩固的整體[6-7]。其效果與骨折愈合過程中植入物和周圍骨組織的相對位移、磨損、新骨重塑密切相關[8-9]。近年來,越來越多的研究集中于尋找既能治療骨質疏松,又能改善種植體的骨整合效果的治療方式[10]。

曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)是一種非選擇性組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi),可促進細胞乙酰化,通過表觀遺傳(epigenetics)修飾調控細胞功能[11-13]。目前TSA已被證實可促進新骨形成,其主要機制與拮抗氧化應激有關[14-15]。但TSA能否促進TI周圍新骨形成,進而增強TI骨整合,目前未見相關報道。本研究旨在探索TSA對TI骨整合的影響,為解決TI松動問題提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD大鼠30只,SPF級,雌性,3月齡,體重200～250 g,由南京市青龍山動物繁殖場提供,生產許可證號:SYXK(皖)2018-004。

1.2 主要材料與儀器

TSA(APExBIO,美國);HE染色試劑盒(博士德,中國);Masson染色試劑盒(銳博,中國);大鼠ELISA試劑盒(ThermoFisher,美國);醫用電鉆(Erbrigh-Instrumente,德國);Micro-CT(Scanco Medical μCT-100,瑞士);酶標儀(BioTek,美國);數字病理切片掃描儀(Motic EASY SCAN,中國);鈦植入物(華創醫療器械,1.5×10.0 mm,中國);電子萬能試驗機(Reger,中國)。

1.3 實驗方法

1.3.1雙側去卵巢術、TI植入和藥物干預:將實驗大鼠分為兩組,雙側去卵巢組(OVX,n=25),假手術組(Sham,n=5)。麻醉大鼠后俯臥位固定,從大鼠背側肋下腎區切開皮膚,鈍性分離皮下組織進入腹腔。結扎輸卵管,切除卵巢。縫合切口并術后肌注青霉素抗感染治療3 d。Sham組大鼠進行相同操作,但僅切除卵巢旁等質量脂肪組織。3個月后兩組各隨機選取5只大鼠處死以驗證骨質疏松模型是否成功建立。隨后,對OVX組剩余20只大鼠行股骨遠端TI植入手術。經膝關節內側切開皮膚,鈍性分離皮下組織暴露股骨內側髁,使用醫用電鉆從內側髁穿透至外側髁做一直徑約1 mm的圓柱形骨缺損,經缺損處置入TI。縫合切口并術后抗感染3 d。待2周大鼠傷口愈合后隨機將大鼠分為2組:對照組(Control,n=10)和TSA組(n=10)。TSA組按500 μg/(kg·d)腹腔注射,連續給藥4周,自由進食水,每天稱重,根據體重計算注射體積,Control組腹腔注射同等體積生理鹽水。給藥結束后觀察2周,隨后處死大鼠進行后續實驗。

1.3.2Micro-CT檢測:取Control組(n=10)和TSA組(n=10)左側股骨樣本行Micro-CT檢測。掃描股骨下段,以TI為中心,選擇直徑3 mm圓柱形區域作為感興趣區(ROI)。評估ROI內骨體積分數(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數目(Tb.N)、連接密度(Conn.D)、骨小梁分離度(Tb.Sp)和結構模型指數(SMI)等。

1.3.3拔釘實驗:取Control組(n=10)和TSA組(n=10)右側股骨樣本盡快行TI軸向拔出力檢測。將股骨標本固定于固定架上,使TI長軸保持豎直。另取固定架的夾持刀片固定TI的螺絲帽,再將固定架與電子萬能試驗機相連,使拉力長軸與TI保持一致,牽拉速度2.0 mm/min,記錄輸出數據并進行分析。

1.3.4組織切片染色:拔除TI后取Control組(n=10)和TSA組(n=10)右側股骨樣本進行組織切片染色。樣本脫鈣后制作石蠟切片,按HE、Masson染色試劑盒說明書分別操作。使用數字病理切片掃描儀保留結果,選取同一水平面TI缺損處上方骨髓及骨小梁滿視野區域進行分析。

1.3.5ELISA法檢測:取Control組(n=10)和TSA組(n=10)大鼠血清以OCN、BMP2 ELISA檢測試劑盒檢測,按說明書操作。使用酶標儀于450 nm測定吸光度(OD)值,根據測試結果計算對應樣本OCN和BMP2在血清中的水平。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 建立骨質疏松模型

取Sham組和OVX組大鼠股骨樣本行Micro-CT掃描和HE染色。Micro-CT結果顯示,與Sham組相比,OVX組大鼠股骨干骺端骨小梁萎縮、斷裂,數量減少(圖1A)。定量分析結果提示,OVX組BMD下降(圖1C),差異有統計學意義(P<0.05)。HE染色顯示,OVX組大鼠骨小梁結構錯亂、變薄,同時伴有萎縮甚至斷裂(圖1B、1D)。提示大鼠骨質疏松模型建立成功。

注:A:股骨干骺端Micro-CT圖像;B:HE染色圖像,標尺=200 μm;C:BMD定量分析;D:ROI骨小梁面積占比;Tb:骨小梁,BM:骨髓。**P<0.01,****P<0.0001。

2.2 Micro-CT分析

Micro-CT三維重建及微結構分析結果顯示,與Control組相比,TSA組TI周圍骨小梁排列密度及數量回升(圖2A)。定量結果分析顯示,TSA組BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D升高,Tb.Sp、SMI降低(P<0.05)(圖2B)。

注:A:股骨干骺端TI及周圍組織三維重建圖像;B:ROI參數定量分析結果。*P<0.05,**P<0.01。

2.3 拔釘實驗結果

Control組螺絲釘軸向拔出力的平均峰值為(36.75±7.37)N。TSA組螺絲釘軸向拔出力的平均峰值為(53.97±11.72)N。如圖3所示,與Control組相比,TSA組的螺絲釘軸向拔出力明顯增高。

注:Control組和TSA組TI軸向拔出力分析結果。**P<0.01。

2.4 骨組織切片染色

與Control組相比,HE染色顯示,TSA組TI周圍骨小梁連接恢復,排列密度增高,厚度增加,數量回升(圖4A、4B)。Masson染色顯示,TSA組骨小梁增多,厚度增加,新骨和膠原纖維增多(圖4C、4D)。

注:A:股骨干骺端HE染色圖像,標尺=200 μm;B:ROI骨小梁面積占比;C:股骨干骺端Masson染色圖像,標尺=200 μm;D:新骨形成速率直方圖;Tb:骨小梁,BM:骨髓,*:成熟骨,#:新生骨和膠原纖維。**P<0.01,***P<0.001。

2.5 ELISA法檢測

ELISA檢測結果如圖5A、5B所示,與Control組相比,TSA組血清中OCN、BMP2水平升高。

注:A:OCN含量定量分析;B:BMP-2含量定量分析。***P<0.001。

3 討論

本研究采用的OVX大鼠模型是研究骨質疏松非常成熟且應用廣泛的動物模型,可模擬人體骨質疏松[16-17]。骨小梁位于骨髓腔中,是骨皮質在骨松質內延伸出來的不規則網狀立體結構,其質量、結構、數量和厚度等都對骨強度有較大影響[18]。Micro-CT顯示,OVX組大鼠股骨BMD低于Sham組,HE染色顯示,OVX組骨小梁數量明顯減少,結構錯亂、萎縮,提示大鼠骨質疏松模型成功建立。在骨質疏松性骨折的治療過程中,TI無菌性松動是很常見的問題,與其周圍骨形成不足密切相關,也在一定程度上限制了TI在骨科手術中的應用[4-5]。考慮到長骨干骺端體積較大便于手術操作,本研究選擇大鼠股骨干骺端作為鈦釘植入部位[19-20]。正如本研究結果顯示,通過Micro-CT掃描及三維重建,發現Control組TI周圍僅可見少量新生骨和骨小梁,骨形成不足。而經TSA處理后的大鼠的TI周圍BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D升高,Tb.Sp、SMI降低,說明桿狀骨小梁轉化為板狀骨小梁增多,即新生骨小梁增多[21]。HE和Masson染色結果顯示,TSA組TI周圍骨小梁、新生骨和膠原纖維增多。在骨愈合過程中,OCN是由成骨細胞分泌的一種多肽,主要作用是維持骨的礦化[22]。BMP2屬于轉化生長因子-β(TGF-β)家族,可以促進成骨細胞分化成熟,參與骨與軟骨的生長發育和重建過程[23]。大鼠血清ELISA檢測結果分析可知,經TSA處理后大鼠血清中OCN、BMP2的水平明顯增加。表明大鼠體內成骨細胞活性增強,成骨能力增強。TI軸向拔出力檢測結果也證明TSA組拔出鈦釘所需軸向力明顯增大,說明TSA組大鼠的TI與股骨結合的更加緊密,骨整合程度更加良好。

有研究表明,氧化應激是骨質疏松癥的關鍵發病機制[24]。核因子-κB受體激活劑配體(RANKL)和骨保護素(OPG)共同維持骨代謝平衡,RANKL抑制成骨,而OPG促進成骨。氧化應激可通過激活蛋白激酶及影響特定轉錄因子表達等機制誘導RANKL上調和OPG下調,并且能直接誘導骨細胞凋亡加重RANKL和OPG的比例失衡,導致骨質疏松和促進其發展。而TSA可以發揮抗氧化作用,通過激活Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Keap1)/核因子E2相關因子2(Nrf2)/抗氧化反應元件(ARE)信號通路,加速Nrf2與Keap1解離,促使Nrf2入核,與ARE抗氧化反應元件結合,調控II相解毒酶基因以及抗氧化酶基因等的表達,拮抗氧化應激,所以TSA是一種潛在的新型骨合成代謝藥物[25]。這一觀點與本研究體內實驗結果一致。為了實現鈦植入物與骨小梁之間更好的骨整合,各種研究都試圖對植入物表面進行改良和(或)促進TI周圍新骨和骨小梁形成[26]。通過查閱文獻發現,目前關于TSA應用于骨質疏松動物模型治療的研究較少,尚未有應用于金屬內植入物動物模型的研究,缺乏體內實驗證據。本研究結果表明,在系統性應用TSA后,成骨相關蛋白表達增加,TI周圍骨小梁增多、新骨形成增多,使得TI與周圍組織結合更加緊密,從而增強TI骨整合。

本研究首次探索了TSA對骨質疏松大鼠TI骨整合的影響。但本研究仍具有一定的局限性。首先,因為是前期研究,所以實驗動物數量有限。其次,本研究只參考并應用了單一劑量的TSA來觀察改善骨整合的效果,未設置濃度梯度,尚未知最合適的劑量。因此后期進一步研究將設置濃度梯度和探索最佳劑量。最后,由于本研究沒有觀察除感興趣區外其他部位的各項參數,因此無法確定TSA僅對TI周圍骨組織還是對全身骨組織都起作用。

綜上所述,本研究首次證實了系統地給予TSA可以上調OCN和BMP2等成骨相關蛋白表達,改善骨小梁微結構、促進新骨形成,從而增強去卵巢大鼠TI骨整合。這表明在骨質疏松性骨折的治療中,應用TSA可能是一種有效的改善植入物骨整合的方法。