銀屑病中濾泡性輔助性T細(xì)胞及IL-21對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響

李思彤 王傲 白彥萍 王英

1北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院 （北京 100029）；2中日友好醫(yī)院皮膚科 （北京 100029）

銀屑病（psoriasis）是一種常見的慢性炎癥性疾病，全球發(fā)病率約2% ～ 3%，除了有皮膚損害外，還可引起代謝綜合征、糖尿病、靜脈血栓栓塞、抑郁癥等其他共病，嚴(yán)重影響著患者的身心健康及生存質(zhì)量［1-4］。銀屑病病因復(fù)雜，具體發(fā)病機(jī)制不明，其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是T 細(xì)胞及其細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫功能異常，尤其是CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群功能失調(diào)在銀屑病發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［5］。目前發(fā)現(xiàn)的CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群包含1 型輔助性T（type 1 T helper，Th1）細(xì)胞、Th2 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、Th22 細(xì)胞、Th9 細(xì)胞及濾泡性輔助性T 細(xì)胞（T follicular helper cells，Tfh cells）。多項(xiàng)研究［6-10］已經(jīng)顯示，不同的CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群均不同程度地參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展。但Tfh 細(xì)胞在銀屑病發(fā)病機(jī)制中研究尚少，具體作用機(jī)制也尚不明確。

Tfh 細(xì)胞最初發(fā)現(xiàn)于淋巴生發(fā)中心，外周血中也同樣存在。其重要特征是高表達(dá)趨化因子受體CXCR5，還可表達(dá)bcl-6、ICOS、PD-1 等多種細(xì)胞因子［11］。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，尋常型銀屑病患者外周血Tfh 細(xì)胞頻率明顯升高，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［12-13］。IL-21 是Tfh 細(xì)胞的主要功能性分子，其受體在淋巴細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞上均有表達(dá)［14］。銀屑病患者外周血中IL-21 表達(dá)較健康人明顯增加［15］。在銀屑病小鼠模型中，IL-21 可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，與小鼠銀屑病皮損嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。以上研究均提示Tfh 細(xì)胞及IL-21 在銀屑病發(fā)病中可能起到重要作用。本研究擬探究體外條件下尋常型銀屑病患者外周血中Tfh 細(xì)胞及其主要功能性細(xì)胞因子IL-21 對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的影響，進(jìn)一步明確Tfh 細(xì)胞在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 銀屑病組：選取15 例就診于中日友好醫(yī)院皮膚科的尋常型銀屑病患者，年齡18 ～ 62歲，平均（38.87 ± 13.64）歲，其中男10例，女5 例。所有患者近3 個(gè)月內(nèi)不曾局部外用皮質(zhì)類固醇激素及鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，近6 個(gè)月內(nèi)不曾系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑及光療；未合并其他免疫性疾病、腫瘤或感染性疾病等。簽署知情同意書后，采集患者臨床信息并使用肝素鈉抗凝管抽取早晨空腹外周血20 mL。對(duì)照組：選取10 名健康志愿者采集早晨空腹外周血20 mL，其性別、年齡與銀屑病組匹配，均無銀屑病家族史且未合并其他免疫性疾病、腫瘤或感染性疾病等。

1.1.2 細(xì)胞來源 HaCaT 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.1.3 主要試劑和儀器 人淋巴細(xì)胞分離液、高爾基體阻斷劑、紅細(xì)胞裂解液、Falcon、Ki67 APC購(gòu)自美國(guó)BD Bioscience 公司，F(xiàn)oxp3 轉(zhuǎn)錄因子染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司，青霉素/鏈霉素溶液、DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，CXCR5 Alexa Fluor 647、CD4 FITC 及IL-21 重組蛋白購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，Anti-human IL-21-mAbs 購(gòu)自瑞典Mabtech公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)。超凈工作臺(tái)為北京半導(dǎo)體設(shè)備廠產(chǎn)品，生物安全柜、臺(tái)式低溫離心機(jī)為美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品，F(xiàn)ACS Araill流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HaCaT 細(xì)胞傳代培養(yǎng)及準(zhǔn)備 HaCaT 細(xì)胞復(fù)蘇后，用含有10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合強(qiáng)度時(shí)，按照1∶3 比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。隨后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT 細(xì)胞，以1 × 105個(gè)/孔種于12 孔板中，用于檢測(cè)細(xì)胞周期及Ki-67；以1 × 104個(gè)/孔種于96 孔板中，用于CCK-8 檢測(cè)HaCaT 細(xì)胞增殖。

1.2.2 流式細(xì)胞儀分選Tfh 細(xì)胞 Ficoll-Hypaque密度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）后，使用PBS 溶液重懸PBMC，混勻后吸取到流式試管中，加入抗人CD4 和CXCR5 流式抗體，混勻后室溫避光染色30 min。每管加入3 mL 的PBS 溶液，混勻，1 600 r/min，離心6 min 棄上清液。再次加入PBS 溶液洗滌1 次，1 600 r/min，離心6 min 棄上清液，加入4.5 mL PBS 溶液放在冰上保存，上機(jī)檢測(cè)，圈出CD4+CXCR5+的Tfh 細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞分組處理

1.2.3.1 HaCaT 細(xì)胞與IL-21 組 將HaCaT 細(xì)胞隨機(jī)分為IL-21 刺激組（加入10 ng/mL 的IL-21 蛋白）和空白對(duì)照組（以相同體積含有10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基代替IL-21 蛋白），置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)72 h 后，用0.125%胰蛋白酶消化5 min，收獲HaCaT 細(xì)胞懸液。

1.2.3.2 HaCaT 細(xì)胞與Tfh 細(xì)胞共培養(yǎng)組 共培養(yǎng)前使用1 μg/mL 的CD3 抗體活化Tfh 細(xì)胞，在HaCaT 細(xì)胞培養(yǎng)孔中按照1∶1 的比例分別加入正常人和銀屑病患者的Tfh 細(xì)胞懸液。本組又分為IL-21 刺激組（加入10 ng/mL 的IL-21 蛋白），中和抗體組（加入1 μg/mL 的Anti-IL-21 中和抗體）以及單純共培養(yǎng)組（加入等體積培養(yǎng)基）。共培養(yǎng)72 h后，輕輕吹打除去未貼壁的Tfh 細(xì)胞，貼壁的HaCaT細(xì)胞用0.125%胰蛋白酶消化5 min，收獲HaCaT 細(xì)胞懸液。

1.2.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)HaCaT 細(xì)胞Ki-67 表達(dá) 將上述HaCaT 細(xì)胞取出用PBS 重懸，調(diào)整每管為2 × 104細(xì)胞。使用Foxp3 轉(zhuǎn)錄因子染色試劑盒按照說明書方法進(jìn)行破膜，加入Ki-67 抗體避光孵育，預(yù)備上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 CCK-8 法檢測(cè)HaCaT 細(xì)胞增殖活性 設(shè)定4 個(gè)復(fù)孔，按照1.2.3 分組處理后共培養(yǎng)72 h，每孔加入CCK-8 試劑10 μL，37 ℃條件下孵育2 h。測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處各孔的吸光度（OD）值。

1.2.6 流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定HaCaT 細(xì)胞周期 將培養(yǎng)結(jié)束后獲取的HaCaT 細(xì)胞離心，1 500 r/min，5 min。棄去上清收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)。用預(yù)冷的1 mL PBS 洗滌兩次，每管加入3 mL 70%預(yù)冷乙醇，在-20 ℃冰箱固定6 h后離心棄去上清液。用預(yù)冷PBS再次洗滌去乙醇。每管中加入濃度為100 μg/mL的RNase A 酶，放入37 ℃的水浴箱溫浴30 min。取出后用PBS 洗滌，棄去上清液，每管中加入500 μL溴化乙錠（PI）避光孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件及Graphpad Prism 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖，兩組間數(shù)據(jù)比較使用Mann-Whitney 秩和檢驗(yàn)，使用Spearman 秩相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，P＜ 0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-21 可促進(jìn)HaCaT 細(xì)胞增殖 CCK-8 法顯示，加入IL-21 后HaCaT 細(xì)胞的增殖活性明顯高于空白對(duì)照組（P＜ 0.000 1）。與空白對(duì)照組比較，IL-21 使HaCaT 細(xì)胞S 期細(xì)胞比例升高，G0/G1期細(xì)胞比例下降，增殖指數(shù)PI 升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。但流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示加入IL-21 未明顯促進(jìn)HaCaT 細(xì)胞中Ki-67 的表達(dá)（P＞0.05）。見表1 及圖1、2。

圖1 IL-21 對(duì)HaCaT 增殖活性及細(xì)胞周期的影響Fig.1 Effects of IL-21 on proliferation and cell cycle of HaCaT cells

圖2 IL-21 對(duì)HaCaT 細(xì)胞Ki-67 表達(dá)的影響Fig.2 Effectsof IL-21 on expression of Ki-67 of HaCaT cells

表1 IL-21 對(duì)HaCaT 細(xì)胞周期的影響Tab.1 Effects of IL-21 on cell cycle of HaCaT cells±s，%

表1 IL-21 對(duì)HaCaT 細(xì)胞周期的影響Tab.1 Effects of IL-21 on cell cycle of HaCaT cells±s，%

注：PI，增殖指數(shù)，PI=（S期+G2M期）/（S期+G0G1期+G2M期）×100%，可表示HaCaT細(xì)胞增殖

分組細(xì)胞周期S PI HaCaT IL-21+HaCaT P值G0/G1 57.81 ± 10.51 47.01 ± 9.02＜ 0.05 42.19 ± 10.51 52.99 ± 9.01＜ 0.05 32.85 ± 8.56 43.73 ± 8.37＜ 0.05 G2/M 9.34 ± 3.71 9.26 ± 2.90＞ 0.05

2.2 Tfh 細(xì)胞與HaCaT 細(xì)胞共培養(yǎng)

2.2.1 Tfh 細(xì)胞可促進(jìn)HaCaT 細(xì)胞增殖 CCK-8法顯示，與Tfh 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)HaCaT 細(xì)胞增殖活性明顯升高（P＜ 0.000 1），銀屑病組較健康對(duì)照組更能促進(jìn)HaCaT 細(xì)胞增殖（P＜ 0.05）；流式細(xì)胞術(shù)顯示銀屑病組Ki-67 有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見圖3。

圖3 Tfh 細(xì)胞對(duì)HaCaT 細(xì)胞增殖活性和Ki-67 表達(dá)的影響Fig.3 Effectsof Tfhcellson proliferation and expressionof Ki-67 of HaCaT cells

2.2.2 阻斷IL-21 可降低Tfh 細(xì)胞對(duì)HaCaT 細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用 IL-21 刺激組中HaCaT 細(xì)胞增殖活性及Ki-67 的表達(dá)均較IL-21 中和抗體組高。在銀屑病組中，中和IL-21 使HaCaT 細(xì)胞增殖活性及Ki-67 的表達(dá)明顯降低（P＜ 0.05），健康對(duì)照組則未見此抑制作用。見表2 及圖4。

圖4 IL-21 對(duì)Tfh 細(xì)胞共培養(yǎng)組中HaCaT 細(xì)胞增殖活性及Ki-67 的影響Fig.4 Effects of IL-21 and Tfh cells on proliferation and expression of Ki-67 of HaCaT cells

表2 IL-21 對(duì)Tfh+HaCaT 細(xì)胞共培養(yǎng)組中HaCaT 細(xì)胞增殖活性及Ki-67 的影響Tab.2 Effects of IL-21 and Tfh cells on proliferation and expression of Ki-67 of HaCaT cells±s

表2 IL-21 對(duì)Tfh+HaCaT 細(xì)胞共培養(yǎng)組中HaCaT 細(xì)胞增殖活性及Ki-67 的影響Tab.2 Effects of IL-21 and Tfh cells on proliferation and expression of Ki-67 of HaCaT cells±s

分組Ki-67（%）細(xì)胞增殖活性（od450）HC 2.49 ± 0.94 3.04 ± 0.73 2.46 ± 0.58 Tfh+HaCaT IL-21 IL-21中和抗體PV 3.42 ± 0.94 3.57 ± 0.69 2.47 ± 0.96 HC 53.80 ± 22.48 68.61 ± 17.78 48.45 ± 20.61 PV 64.29 ± 10.45 61.28 ± 22.01 42.13 ± 18.92

2.2.3 Tfh 細(xì)胞及IL-21 對(duì)HaCaT 細(xì)胞周期的影響 Tfh-HaCaT 細(xì)胞單純共培養(yǎng)時(shí)，銀屑病組較健康對(duì)照組G0/G1期縮短、PI 升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。IL-21 刺激時(shí)，銀屑病組及健康對(duì)照組的HaCaT 細(xì)胞均較中和抗體組G0/G1期比例降低、PI升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。阻斷IL-21 使HaCaT 細(xì)胞S 期細(xì)胞比例降低、G0/G1期細(xì)胞比例升高、PI降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。見表3 及圖5。

圖5 Tfh 細(xì)胞及IL-21 對(duì)HaCaT 細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effects of Tfhcells and IL-21 on cell cycle of HaCaT cells

表3 Tfh 細(xì)胞及IL-21 對(duì)HaCaT 細(xì)胞周期的影響Tab.3 Effects of Tfh cells and IL-21 on cell cycle of HaCaT cells±s

表3 Tfh 細(xì)胞及IL-21 對(duì)HaCaT 細(xì)胞周期的影響Tab.3 Effects of Tfh cells and IL-21 on cell cycle of HaCaT cells±s

注：HC：健康對(duì)照組；PV：銀屑病組；T+H：Tfh細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)組；T+H+I：向Tfh細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)組加入IL-21；T+H+A：向Tfh細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)組加入IL-21中和抗體

分組細(xì)胞周期（%）S PI 45.68 ± 10.18 52.87 ± 9.86 41.01 ± 9.62 53.82 ± 6.03 50.04 ± 6.46 43.07 ± 8.91 HC-T+H HC-T+H+I HC-T+H+A PV-T+H PV-T+H+I PV-T+H+A G0/G1 54.33 ± 10.18 47.13 ± 9.86 58.98 ± 9.62 46.18 ± 6.03 49.96 ± 6.46 56.93 ± 8.91 37.11 ± 10.79 41.77 ± 7.62 33.06 ± 9.77 43.86 ± 9.00 39.50 ± 6.91 33.54 ± 8.19 G2/M 8.57 ± 3.86 11.10 ± 3.13 7.95 ± 2.58 9.96 ± 4.48 10.55 ± 3.43 9.53 ± 2.31

3 討論

Tfh 細(xì)胞是一種CD4+輔助性T 細(xì)胞，在傳染性疾病、自身免疫疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥等疾病中均有一定作用，是連接細(xì)胞免疫與體液免疫的橋梁［16-17］。Tfh 細(xì)胞高表達(dá)CXCR5，還可表達(dá)ICOS、PD-1 以及BCL-6 等，為B 細(xì)胞成熟和生成抗體提供輔助功能［18-19］。結(jié)合文獻(xiàn)和課題組前期研究，在尋常型銀屑病患者外周血中CD4+CXCR5+的Tfh 細(xì)胞數(shù)量較健康人明顯增多且處于活化狀態(tài)，與銀屑病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［11，13］。銀屑病患者皮損中浸潤(rùn)的Tfh 細(xì)胞數(shù)量也較非皮損部位明顯增加［12］。IL-21是活化CD4+T 細(xì)胞的標(biāo)志，也是Tfh 細(xì)胞的主要功能性分子，由Tfh 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞以及NK 細(xì)胞產(chǎn)生，具有多種功能，可影響多種免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞［9］。IL-21 可調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的發(fā)育、增殖和功能，如IL-21 可影響T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的分化增殖，誘導(dǎo)幼稚B 細(xì)胞和記憶B 細(xì)胞分化為漿細(xì)胞［9］；還可誘導(dǎo)成熟CD8+T 細(xì)胞以及NK 細(xì)胞，并增強(qiáng)其細(xì)胞毒性［11］。此外，IL-21 還可抑制樹突狀細(xì)胞的抗原提呈功能，并可促進(jìn)B 細(xì)胞和NK 細(xì)胞的凋亡。許多研究［12-14］表明IL-21 在自身免疫性疾病、炎性疾病和腫瘤中起重要作用，而銀屑病患者中IL-21 表達(dá)也較健康對(duì)照明顯增多［15］。Tfh 細(xì)胞是IL-21 的主要來源，而IL-21 又可對(duì)Tfh 細(xì)胞的初始發(fā)育進(jìn)行刺激［16］。因此，本研究以IL-21 為切入點(diǎn)，在體外條件下探究尋常型銀屑病中Tfh 細(xì)胞對(duì)HaCaT 細(xì)胞的影響。

在本實(shí)驗(yàn)中，首先探究了IL-21 在體外條件下對(duì)HaCaT 細(xì)胞的影響。CCK-8 法提示加入IL-21后HaCaT 細(xì)胞在450 nm 波長(zhǎng)處吸光度值增強(qiáng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期則提示IL-21 刺激組S 期細(xì)胞比例升高，G0/G1期細(xì)胞比例下降，說明IL-21在體外可促進(jìn)HaCaT 細(xì)胞增殖活化，而銀屑病的典型病理特征之一即棘層肥厚，由此推斷IL-21 有可能是銀屑病的致病因子之一。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-21 刺激后HaCaT 細(xì)胞Ki-67 的表達(dá)未見明顯增強(qiáng)，與另外兩種實(shí)驗(yàn)方法得出的結(jié)論不甚一致，推測(cè)是由于Ki-67 的表達(dá)屬于半定量統(tǒng)計(jì)且樣本量較小，可能存在一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)偏差，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量或使用細(xì)胞免疫組化統(tǒng)計(jì)Ki-67 的表達(dá)。當(dāng)與Tfh 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，無論銀屑病組與健康對(duì)照組，HaCaT 細(xì)胞增殖活性均提高，銀屑病組的促進(jìn)作用更強(qiáng)；在銀屑病組中，IL-21中和抗體組與Tfh+HaCaT 單純共培養(yǎng)組比較，可將 HaCaT 細(xì)胞阻滯于 G0/G1期，減少 S 期細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而抑制Tfh 細(xì)胞對(duì)HaCaT 細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。由此推測(cè)Tfh 細(xì)胞可能通過IL-21 引起角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖，從而促進(jìn)銀屑病的發(fā)生。

綜上，本研究首次探討銀屑病患者外周血Tfh細(xì)胞在體外條件下對(duì)HaCaT 細(xì)胞的影響，在細(xì)胞水平進(jìn)一步探討了銀屑病可能的發(fā)病機(jī)制，闡述了Tfh 細(xì)胞及其主要功能分子IL-21 在銀屑病發(fā)生發(fā)展中的可能作用。但I(xiàn)L-21 能否成為銀屑病免疫治療的新靶點(diǎn)，尚需進(jìn)一步研究。

【Author contributions】LI Sitong performed the experiments and wrote the article.WANG Ao and BAI Yanping revised the article.WANG Ying designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.