血必凈通過miR-155/JAK2/STAT1信號通路對肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎大鼠肺組織損傷的影響

尉飛 王湘雨 劉志勇

1河南省中醫院（河南中醫藥大學第二附屬醫院）（鄭州 450000）；2河南中醫藥大學第二臨床醫學院 （鄭州 450011）

肺炎克雷伯菌是常見的致病菌，其引發的重癥肺炎（SP）在臨床上最為常見，近年來，克雷伯桿菌肺炎的發病率逐年升高［1-2］。由于該類肺炎對一般抗生素具有一定的耐藥性，因此，尋找有效的治療藥物具有重要意義［3］。血必凈是紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸等提取物的注射液，臨床上用于SP 及臟器衰竭等。近年來，有研究［4-5］證實血必凈能夠通過調控miR-233、miR-17-5P 等微小RNA，對肝、肺等的重要臟器起到保護作用損傷，因此，推測血必凈能夠通過某種機制調控微小RNA，降低SP 對肺部的損傷。微小RNA-155（miR-155）是一種多功能基因，轉錄后能夠抑制目的基因的表達，參與免疫反應、炎癥反應及腫瘤的發生與發展等，是SP 研究中熱門的基因之一，目前，血必凈對SP 大鼠肺組織損傷的影響研究較少，其作用機制尚不清楚，而JAK2/STAT1 通路參與細胞的增殖、分化等多種途徑，是免疫調節的重要通路［6-7］。因此，本研究通過建立SP 大鼠模型，探究血必凈通過miR-155/JAK2/STAT1 通路對SP 大鼠肺組織損傷的影響，為治療該疾病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級、SD雄性大鼠，體質量185 ～215 g，平均（200 ± 15）g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證為［生產許可SCXK（京）2019-0010］。本研究經院動物倫理委員會審批通過。

1.2 主要試劑與儀器 血必凈注射液（國藥準字Z20040033，天津紅日藥業股份有限公司）；miR-155 激動劑購于廣州瑞博生物科技有限公司；肺炎克雷伯菌標準菌株購于上海碩欣生物科技有限公司；戊巴比妥鈉（CAS：57-33-0，上海哈靈生物科技有限公司）；多聚甲醛（CAS：30525-89-4，上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司；TRIzol 試劑盒購于武漢純度生物科技有限公司；IFN-γ、IL-4 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購于北京康瑞納生物科技有限公司；受體酪氨酸激酶2（JAK2）及其山羊抗兔二抗購于深圳市豪地華拓生物科技有限公司；信號轉導和轉錄激活因子1（STAT1）單克隆抗體及及其山羊抗兔二抗（上海圻明生物科技有限公司）。

離心機（型號：M1324R，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；分析天平（型號：FA2204C，北京佳源興業科技有限公司）；恒濕恒溫箱購于上海連橋生物科技有限公司；Premier3000 大小鼠血氣分析儀購于上海玉研科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠模型建立及分組 將肺炎克雷伯菌，以生理鹽水稀釋為1.2 × 109cfu/mL 的菌液，備用。取50 只SD 雄性大鼠，隨機選取8 只為對照組，其余大鼠建立SP 模型。將所有大鼠稱重后進行麻醉處理（30 mg/kg，2%戊巴比妥鈉），麻醉后固定于鼠板，對頸部進行常規消毒、備皮，暴露出氣管上端，除對照組外，采用注射器經氣管注入3 mL菌液，對照組注入等量的生理鹽水。接種后使大鼠保持直立20 s，便于菌液進入肺部，縫合傷口，密切關注大鼠生命體征。當大鼠、表情呆滯、呼吸急促、活動量明顯減少，且經血氣分析儀檢測動脈氧分壓≤ 8 kPa 時，建模成功［8］。

建模過程中2 只建模過程中死亡，其余大鼠隨機分為模型組，miR-155 激動劑組，血必凈低、高組及miR-155 激動劑+血必凈組，每組各8 只。

1.3.2 藥物處理 參照人與大鼠藥物計量換算系數［9］，miR-155 激動劑組給予miR-155 激動劑80 mg/kg，血必凈低、高劑量組分別給予血必凈注射液4、8 mg/kg，miR-155 激動劑+血必凈組給予miR-155 激動劑80 mg/kg 和血必凈8 mg/kg，對照組與模型組均給予等量的生理鹽水，均尾靜脈注射，每天1 次，連續給藥7 d。

1.3.3 標本采集及處理 給藥7 d 后，禁食12 h，采集大鼠眼眶靜脈血5 mL，2 mL 冷藏保存，用于miR-155 檢測，剩余血液離心5 min（轉速：5 000 r/min，離心半徑：10 cm），取上層血清，于-80 ℃冷藏箱中冷凍保存。所有大鼠麻醉后處死，取大鼠全肺，用于稱重并計算肺系數（LI），每組取4 只大鼠全肺用于測量濕重/干重比值（W/D），另外4 只右肺于4%多聚甲醛固定，用于HE 染色，左肺于液氮中冷凍保存，用于qRT-PCR 及免疫印跡法檢測mRNA 及蛋白表達量。

1.3.4 大鼠肺系數（LI）及濕重/干重比值（W/D）取大鼠全肺，采用濾紙擦干肺組織表面水分，稱重，根據公式計算LI，［LI=肺質量（mg）/體質量（g）×10］。稱取全肺濕重后，置于恒溫箱（80 ℃）中連續烘烤20 h，稱取干重，計算W/D 值。

1.3.5 大鼠血清白細胞介素-1β（L-1β）、白細胞介素-18（L-18）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平 取上清液，室溫解凍后進行血清IL-1β、IL-18及TNF-α水平檢測，采用全自動生化分析儀，以酶聯免疫（ELISA）雙抗夾心法進行檢測，按照相應ELISA 試劑盒說明書操作。

1.3.6 大鼠肺組織病理檢測 取部分固定的大鼠肺組織，乙醇脫水后進行石蠟包埋，切片（4 μm）后進行HE 染色，采用光學顯微鏡觀察大鼠肺組織水腫、炎癥細胞浸潤等病理學變化。

1.3.7 qRT-PCR 檢測大鼠miR-155 表達情況［10］取靜脈血2 mL，室溫解凍后根據TRIzol 試劑盒說明書，提取總RMA，經逆轉錄反應得到cDNA，進行qRT-PCR 檢測根據試劑盒說明書建立反應體系：Master Mix10 μL，cDNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL，TaqDNA 聚合酶酶0.4 μL；純水加至20 μL；反應條件：95 ℃，30 s→60 ℃，15 s→72 ℃，10 s，循環40 次。以U6 為內參，采用2-△△CT法計算miR-155表達量，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Tab.1 PCR primevs

1.3.8 大鼠肺組織JAK2、STAT1 mRNA 表達情況 取部分凍存肺組織約0.5 g，研磨成勻漿，采用TRIzol法提取肺組織總RMA，經逆轉錄得到cDNA，按照熒光定量PCR 試劑盒說明書進行操作，建立反應體系（10 μL）：SYBR Green 10 μL，cDNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL；擴增條件：95 ℃，30 s，60 ℃，15 s，72 ℃，10 s，循環40 次［11］。以GAPDH 為內參，采用2-△△CT法計算JAK2、STAT1 mRNA 表達量，引物序列見表2。

表2 PCR 引物序列Tab.2 PCR primevs

1.3.9 大鼠肺組織JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1 蛋白表達情況 取部分液氮保存的肺組織，將其研磨成勻漿并加入RIPA 緩沖液，離心后提取上清液，采用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，煮沸5 min 后進行電泳，分離目的蛋白，轉膜后室溫封閉2 h，加入兔抗大鼠JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1 一抗及內參，4 ℃孵育過夜，沖洗后加入山羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，再次沖洗，最終進行ECL 顯影，并分析結果。蛋白表達量為目的蛋白條與β-Actin 帶灰度值的比值［12］。

1.4 統計學方法 用SPSS 22.0 軟件分析數據，符合正態分布的計量資料均以均數±標準差表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠LI 及肺W/D 值比較 與對照組比較，模型組LI 及肺W/D 值均升高（P＜ 0.05）；與模型組比較，miR-155 激動劑組LI 及肺W/D 值升高，血必凈低、高劑量組及miR-155 激動劑+血必凈組LI 及肺W/D 值均降低（P＜ 0.05）；與miR-155 激動劑組比較，血必凈低、高劑量組及miR-155 激動劑+血必凈組LI 及肺W/D 值均降低（P＜ 0.05），與血必凈低劑量組比較，血必凈高劑量組LI 及肺W/D 值升高（P＜ 0.05），與血必凈高劑量組比較，miR-155激動劑+血必凈組LI 及肺W/D 值升高（P＜ 0.05）。見圖1。

圖1 大鼠LI 及肺W/D 值Fig.1 LI and lung W/D values in rats

2.2 大鼠血清IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平比較 與對照組比較，模型組IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平均升高（P＜ 0.05）；與模型組比較，miR-155 激動劑組IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平升高，血必凈低、高劑量組及miR-155 激動劑+血必凈組IL-1β、IL-18及TNF-α水平降低（P＜ 0.05）；與miR-155激動劑組比較，血必凈低、高劑量組及miR-155 激動劑+血必凈組IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平降低（P＜ 0.05），與血必凈低劑量組比較，血必凈高劑量組IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平降低（P＜ 0.05），與血必凈高劑量組比較，miR-155 激動劑+血必凈組IL-1β、IL-18及TNF-α 水平升高（P＜ 0.05）。見表3。

表3 大鼠血清IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平比較Tab.3 Comparison of serum IL-1β，IL-18 and TNF-α levels in rats ±s，mg/kg

表3 大鼠血清IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平比較Tab.3 Comparison of serum IL-1β，IL-18 and TNF-α levels in rats ±s，mg/kg

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與miR-155激動劑組比較，cP＜0.05；與血必凈低劑量組比較，dP＜0.05；與血必凈高劑量組比較，eP＜0.05

TNF-α 66.53 ± 5.22 102.31 ± 7.34a 118.28 ± 9.26ab 84.68 ± 7.08abc 75.85 ± 6.82abcd 83.71 ± 7.25abde組別對照組模型組miR-155激動劑組血必凈低劑量組血必凈高劑量組miR-155激動劑+血必凈組鼠量8 8 8 8 8 8 IL-1β 52.83 ± 6.12 87.48 ± 8.24a 96.38 ± 9.24ab 80.31 ± 8.35abc 66.23 ± 6.03abcd 79.77 ± 8.05abde IL-18 92.34 ± 8.38 238.87 ± 10.54a 253.15 ± 12.06ab 172.38 ± 7.49abc 113.23 ± 10.03abcd 168.77 ± 9.05abde

2.3 大鼠肺組織病理檢測結果 對照組：肺組織結構完整，肺泡大小均勻；模型組：肺泡完整性遭到破壞，可見肺泡水腫，肺間質增厚，伴隨炎癥細胞浸潤；miR-155 激動劑組：肺泡結構破壞、水腫等情況較模型組嚴重，炎癥細胞浸潤增多；血必凈低劑量組：肺泡結構部分恢復，水腫減輕，炎癥細胞浸潤部分減少；血必凈高劑量組：肺泡結構基本恢復，水腫減輕，炎癥細胞浸潤明顯減少；miR-155 激動劑+血必凈組：肺泡結構部分恢復，水腫部分減輕，炎癥細胞浸潤明顯局部減少，但減輕程度小于血必凈高劑量組。見圖2。

2.4 大鼠miR-155 表達量比較 與對照組比較，模型組miR-155 表達升高（P＜ 0.05）；與模型組比較，miR-155 激動劑組miR-155 表達升高，血必凈低、高劑量組及miR-155 激動劑+血必凈組miR-155表達均降低（P＜ 0.05）；與miR-155 激動劑組比較，血必凈低、高劑量及miR-155 激動劑+血必凈組miR-155表達降低（P＜ 0.05），與血必凈低劑量組比較，血必凈高劑量組miR-155 表達降低（P＜ 0.05），與血必凈高劑量組比較，miR-155 激動劑+血必凈組miR-155 表達升高（P＜ 0.05），見表4。

表4 大鼠miR-155 表達量比較Tab.4 Comparison of relative expression levels of rat miR-155 ±s

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與模型組比較，bP ＜ 0.05；與miR-155激動劑組比較，cP ＜ 0.05；與血必凈低劑量組比較，dP ＜ 0.05；與血必凈高劑量組比較，eP ＜ 0.05

miR-155 1.00 ± 0.02 3.29 ± 0.72a 3.72 ± 0.82ab 2.63 ± 0.61abc 1.90 ± 0.55abcd 2.60 ± 0.60abce組別對照組模型組miR-155激動劑組血必凈低劑量組血必凈高劑量組miR-155激動劑+血必凈組鼠量8 8 8 8 8 8

2.5 大鼠肺組織JAK2、STAT1 mRNA 表達情況 與對照組比較，模型組JAK2、STAT1 mRNA 表達升高（P＜ 0.05）；與模型組比較，miR-155 激動劑組JAK2、STAT1 mRNA 表達升高，血必凈低、高劑量組及miR-155 激動劑+血必凈組JAK2、STAT1 mRNA 表達均降低（P＜ 0.05）；與miR-155 激動劑組比較，血必凈低、高劑量組及miR-155 激動劑+血必凈組JAK2、STAT1 mRNA表達降低（P＜ 0.05），與血必凈低劑量組比較，血必凈高劑量組JAK2、STAT1 mRNA表達降低（P＜ 0.05），與血必凈高劑量組比較，miR-155 激動劑+血必凈組JAK2、STAT1 mRNA 表達升高（P＜ 0.05），見表5。

表5 大鼠肺組織JAK2、STAT1 mRNA 表達量比較Tab.5 Comparison of the relative expression of JAK2 and STAT1 mRNA in rat lung tissue ±s

表5 大鼠肺組織JAK2、STAT1 mRNA 表達量比較Tab.5 Comparison of the relative expression of JAK2 and STAT1 mRNA in rat lung tissue ±s

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與模型組比較，bP ＜ 0.05；與miR-155激動劑組比較，cP ＜ 0.05；與血必凈低劑量組比較，dP ＜ 0.05；與血必凈高劑量組比較，eP ＜ 0.05

STAT1 mRNA 1.00 ± 0.03 3.31 ± 1.26a 4.07 ± 1.68ab 2.98 ± 0.43abc 2.27 ± 0.77abcd 3.02 ± 0.48abde組別對照組模型組miR-155激動劑組血必凈低劑量組血必凈高劑量組miR-155激動劑+血必凈組鼠量8 8 8 8 8 8 JAK2 mRNA 1.00 ± 0.05 2.89 ± 0.96a 3.27 ± 1.01ab 1.88 ± 0.44abc 1.31 ± 0.24abcd 1.90 ± 0.40abde

2.6 大鼠肺組織JAK2、STAT1 蛋白表達情況 與對照組比較，模型組p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 升高（P＜ 0.05）；與模型組比較，miR-155 激動劑組p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 升高，血必凈低、高劑量組及miR-155 激動劑+血必凈組p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 均降低（P＜ 0.05）；與miR-155 激動劑組比較，血必凈低、高劑量組及miR-155激動劑+血必凈組p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1降低（P＜ 0.05），與血必凈低劑量組比較，血必凈高劑量組p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 降低（P＜0.05），與血必凈高劑量組比較，miR-155 激動劑+血必凈組p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 升高（P＜0.05），見表6、圖3。

圖3 肺組織JAK2、STAT1 蛋白表達圖Fig.3 Expression of JAK2 and STAT1 protein in lung tissue

表6 大鼠肺組織p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 比較Tab.6 Comparison of p-JAK2/JAK2，p-STAT1/STAT1 in rat lung tissue ±s

表6 大鼠肺組織p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 比較Tab.6 Comparison of p-JAK2/JAK2，p-STAT1/STAT1 in rat lung tissue ±s

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與模型組比較，bP ＜ 0.05；與miR-155激動劑組比較，cP ＜ 0.05；與血必凈低劑量組比較，dP ＜ 0.05；與血必凈高劑量組比較，dP ＜ 0.05

p-STAT1/STAT1 0.31 ± 0.03 0.58 ± 0.03a 0.81 ± 0.02ab 0.41 ± 0.04abc 0.29 ± 0.04abcd 0.43 ± 0.04abde組別對照組模型組miR-155激動劑組血必凈低劑量組血必凈高劑量組miR-155激動劑+血必凈組鼠量4 4 4 4 4 4 p-JAK2/JAK2 0.24 ± 0.02 0.48 ± 0.04a 0.83 ± 0.03ab 0.26 ± 0.04abcd 0.21 ± 0.03abcd 0.28 ± 0.04abde

3 討論

血必凈是一種中藥注射液，主要成分為紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸等中藥材提取物，臨床中常用作呼吸道等疾病的炎癥反應或器官衰竭的治療［13］。肺炎克雷伯菌引發的SP，或對肺組織造成不同程度的損傷，由于該類肺炎對常規抗生素具有一定的抗藥性，因此中藥被開始治療該類疾病［14-15］。有研究［16］顯示血必凈對于應激性器官損傷具有一定的保護作用，因此，推測血必凈對SP 大鼠肺組織損傷具有一定的保護作用。JAK2/STAT1 信號通路與機體的免疫作用相關，而miR-155 在免疫調節中具有重要作用，同時在炎癥反應的研究中較為熱門［17-19］。本研究建立SP 大鼠，探究血必凈通過miR-155/JAK2/STAT1 通路對SP 大鼠肺組織損傷影響及其作用機制。

本研究對各組SP 大鼠的LI，肺W/D 及血清炎癥因子進行檢測，結果顯示模型組LI，肺W/D，IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平升高，表明SP 會引發炎癥反應，并對肺組織造成一定損傷，而miR-155 激動劑會加重炎癥反應及肺損傷；在給予模型大鼠或miR-155 激動劑模型大鼠血必凈后，LI，肺W/D，IL-1β、IL-18 及TNF-α 水平上升，IL-1β、IL-18 及TNF-α 均為促炎因子，注射血必凈后，促炎因子受到抑制，表明血必凈對于炎癥反應有很好的抑制作用，進而減少對肺組織的損傷，起到保護肺組織的作用，同時能夠減少部分miR-155 激動劑帶來的損傷，其中高劑量血必凈保護作用更強。分析原因為，血必凈注射液中具有紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸五中中藥提取物，多個治療靶點，具有更好的抗炎效果，同時還具有抗氧化、改善微循環，保護上皮細胞的作用，通過多種機制對SP 造成的肺損傷具有一定的保護作用［20-21］。另外大鼠的肺組織病理學結果顯示，miR-155 能夠增加SP對肺組織造成的結構破壞，加重水腫及炎癥細胞浸潤，而血必凈則會改善肺泡結構，減輕水腫，減少炎癥細胞浸潤，推測其能夠通過抑制炎癥反應減輕肺部損傷。

JAK2/STAT1 通路是免疫調節反應中的重要途徑，參與細胞的增殖、分化等，多數細胞因子由該通道進行信號轉導［22-23］。吳舒懋等［24］研究而結果顯示，SP 肺組織中，升高mir-34a 表達，能夠抑制sirt1 表達，加重肺損傷；降低mir-34a 表達表達，能夠促進sirt1 表達，減輕肺損傷。吳程程［25］等證實，血必凈通過調控p38 MAPK/NF-kB 通路，降低百草枯中毒大鼠的炎癥反應，減少對肺組織的損傷。根據以上研究結果推測血必凈可能通過miR-155調控JAK2/STAT1 通路，起到對肺部的保護作用。本研究結果顯示，模型組、miR-155激動劑組JAK2、STAT1 mRNA 及p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 升高，表明SP 的會激活JAK2/STAT1 通路，該通路可能由miR-155 進行調控，當JAK2 激活后，使STAT1磷酸化形成p-STAT1，STAT1 活化巨噬細胞系統，調控促炎因子的表達，促進炎癥反應［26］。另外，血必凈低、高劑量組及miR-155 激動劑+血必凈組JAK2、STAT1 及p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1 降低，表明血必凈可抑制JAK2/STAT1 通路，從而抑制SP 引起的炎癥反應，同時能降低部分miR-155激動劑對JAK2/STAT1 通路的激活作用，提示血必凈對JAK2/STAT1 通路的調控作用可能是通過miR-155 進行。

綜上所述，miR-155 在SP 大鼠肺組織中表達升高，血必凈能夠通過抑制miR-155 降低JAK2/STAT1 信號通路，減輕肺損傷。但本研究具有一定的局限性，僅對肺部損傷的可能機制之一進行研究，而肺損傷會受到多種通路及因子影響，因此應對其他可能機制進行深入研究，為臨床治療SP提供給新有效藥物；在外界條件限制下未設置miR-155 拮抗劑組為血必凈的作用機制提供佐證，可作為研究方向，進一步驗證血必凈可能機制。

【Author contributions】WEI Fei performed the experiments and wrote the article.WANG Xiangyu performed the experiments.WANG Xiangyu and LIU Zhiyong revised the article.LIU Zhiyong designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.