轉鐵蛋白受體1 和血管內皮生長因子在兒童及青少年骨肉瘤患者中的表達及臨床意義△

戴若恒，刁玉巧#，朱秀麗，陳健，鄭鈺，江蓮，曲凡

河北醫科大學第四醫院兒科，石家莊 050000

骨肉瘤是兒童和青少年時期最常見的原發性侵襲性骨惡性腫瘤，好發于長骨干骺端[1-2]。隨著醫學水平的進步，手術切除聯合放化療使骨肉瘤患者的生存率提高至60%～70%，但仍有30%～40%的患者伴有肺轉移或早期復發，其生存率降低至20%左右[3]。因此，在分子水平上進一步探索骨肉瘤的診斷和治療方法，尋找新的預后相關生物標志物，開展新的治療策略迫在眉睫。轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）是一種細胞膜相關糖蛋白，參與細胞內鐵攝取，與腫瘤的發生發展關系密切。既往研究表明，TFR1 在多種惡性腫瘤中呈高表達，例如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、急性白血病、淋巴瘤以及惡性膠質瘤等[4-5]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最重要的血管生成刺激因子之一，可能參與癌變。以往研究表明，VEGF 過表達對多種腫瘤細胞的生長和存活至關重要，VEGF 高表達與骨肉瘤患者的預后不良相關[6-7]。目前，有關TFR1 和VEGF 在兒童及青少年骨肉瘤組織中表達相關性的研究較少。本研究探討TFR1 和VEGF 在兒童及青少年骨肉瘤組織中的表達情況，分析其與骨肉瘤患者臨床特征和預后的關系及二者的相關性，探討其在骨肉瘤發生發展、侵襲、遠處轉移中的作用，旨在為兒童及青少年骨肉瘤患者的輔助診斷、治療及預后評估提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011 年1 月至2020 年12 月河北醫科大學第四醫院收治的兒童及青少年骨肉瘤患者。納入標準：①經病理檢查確診為骨肉瘤；②首次確診，年齡﹤18 歲；③接受手術治療；④臨床資料、治療方案、隨訪資料完整。排除標準：①合并其他系統原發惡性腫瘤；②術前接受過化療、放療、中醫中藥治療、靶向治療、免疫治療等抗腫瘤治療；③圍手術期死亡；④合并嚴重心肺功能不全或病情危重。依據納入和排除標準，本研究共納入35 例患者，男20 例，女15 例；年齡5～18 歲，平均10.58 歲。收集患者的骨肉瘤組織35 例和癌旁正常組織35例。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者家屬均知情同意。

1.2 免疫組化染色法檢測TFR1和VEGF蛋白表達

根據鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（peroxidase streptavidin，SP）免疫組化試劑盒說明書進行免疫組化染色，所有組織標本均經10%甲醛溶液固定24 h，常規石蠟包埋，4 μm 連續切片，二甲苯常規脫蠟，梯度乙醇脫水；在檸檬酸緩沖液中進行抗原修復，過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性；滴加鼠抗TFR1 單克隆抗體（1∶100）、鼠抗VEGF 單克隆抗體（1∶100），4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗后，滴加生物素標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（濃度1 mg/ml），室溫孵育1 h，磷酸鹽緩沖液沖洗后，二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。采用試劑盒提供的陽性切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3 免疫組化染色結果判定

每張切片隨機選取5 個高倍鏡（×400）視野，每個視野計數100 個細胞，根據陽性細胞百分比和染色強度進行評分。陽性細胞百分比評分：陽性細胞百分比﹤1%為0 分，≥1%且﹤25%為1 分，≥25%且﹤50%為2 分，≥50%且﹤80%為3 分，≥80%為4分。染色強度評分：未染色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。陽性細胞百分比評分與染色強度評分相乘，0～3 分為低表達（-或+），4～6 分為中表達（++），﹥6 分為高表達（+++）。

1.4 隨訪方法

采用電話、門診等方式對所有患者進行隨訪，隨訪截止時間為2021年12月，隨訪時間為5～60個月。

1.5 觀察指標

比較骨肉瘤組織和癌旁正常組織中TFR1 和VEGF 表達情況，比較不同臨床特征兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1 和VEGF 表達情況，比較不同TFR1、VEGF 表達情況兒童及青少年骨肉瘤患者的生存情況，分析兒童及青少年骨肉瘤患者中TFR1 與VEGF 表達的相關性。

1.6 統計學方法

采用SPSS 23.0 軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank 檢驗；相關性分析采用Spearman 相關分析。以P﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織和癌旁正常組織中TFR1 和VEGF表達情況的比較

兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1和VEGF 中高表達率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統計學意義（χ2=20.696、30.629，P﹤0.01）。（表1、圖1）

圖1 骨肉瘤組織和癌旁正常組織中TFR1和VEGF表達情況（免疫組化染色，×400）

表1 兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織和癌旁正常組織中TFR1 和VEGF 的表達情況[n（%）]

2.2 不同臨床特征兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1 和VEGF 表達情況的比較

不同性別、腫瘤直徑兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1 和VEGF 表達情況比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）。中低分化、有遠處轉移、Enneking 分期為Ⅱ～Ⅲ期兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1 中高表達率分別高于高分化、無遠處轉移、Enneking 分期為Ⅰ期的患者，差異均有統計學意義（χ2=6.286、4.119、6.815，P=0.007、0.018、0.006）。中低分化、有遠處轉移、Enneking 分期為Ⅱ～Ⅲ期兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中VEGF 中高表達率分別高于高分化、無遠處轉移、Enneking 分期為Ⅰ期的患者，差異均有統計學意義（χ2=8.203、3.038、3.656，P=0.003、0.037、0.033）。（表2）

表2 不同臨床特征兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1 和VEGF 的表達情況

2.3 生存情況的比較

TFR1 低表達兒童及青少年骨肉瘤患者的生存情況優于TFR1 中高表達患者，差異有統計學意義（χ2=13.500，P﹤0.05）。VEGF 低表達兒童及青少年骨肉瘤患者的生存情況優于VEGF 中高表達患者，差異有統計學意義（χ2=8.779，P﹤0.05）。（圖2、圖3）

圖2 TFR1低表達（n=9）和TFR1中高表達（n=26）兒童及青少年骨肉瘤患者的生存曲線

圖3 VEGF低表達（n=8）和VEGF中高表達（n=27）兒童及青少年骨肉瘤患者的生存曲線

2.4 TFR1 與VEGF 表達的相關性

Spearman 相關分析結果顯示，兒童及青少年骨肉瘤患者中TFR1 與VEGF 的表達呈正相關（r=0.669，P﹤0.05）。

3 討論

骨肉瘤是最常見的骨骼系統惡性腫瘤之一，好發于兒童及青少年，占所有骨惡性腫瘤的30%和兒科腫瘤的3%～4%[8]。據報道，骨肉瘤是青春期第三大常見惡性腫瘤，可能與青春期骨生長過快有關[9-10]。骨肉瘤的發生發展可能與骨生長過快、染色體異常、抑癌基因異常、轉錄因子異常高表達或活性增加、生長因子和微小RNA（microRNA，miRNA）等異常表達有關[11]。該病起病隱匿，惡性程度高，進展快，15%～20%的患者在初診時已發生遠處轉移，嚴重影響患者的身心健康、生活質量和預后[12]。隨著醫療水平的發展，骨肉瘤患者的5 年生存率提高至60%～70%，由于其局部侵襲性強，易早期轉移，且腫瘤細胞易產生化療耐藥性，骨肉瘤患者的生存率仍不能令人滿意。因此，臨床亟需探索新的生物標志物作為兒童及青少年骨肉瘤患者早期診斷、病情和預后評估的參考指標，從而制訂有效的靶向治療方案。

鐵是細胞維持正常生理功能所必需的微量元素，廣泛參與機體重要的生命代謝過程。研究指出，鐵代謝失衡和鐵蓄積可能與腫瘤的發生發展有關，其中鐵代謝相關蛋白調節失衡在腫瘤發生發展過程中發揮重要作用[13]。TFR1 是在所有有核細胞的細胞膜中表達的Ⅱ型跨膜糖蛋白，參與并介導鐵的攝取，對細胞的生長和增殖發揮重要作用。惡性腫瘤細胞的快速增殖使其需鐵量大大增加，細胞需要從細胞質中吸收更多的鐵滿足自身增殖需求。TFR1 在鐵吸收過程中扮演重要角色，在分裂旺盛的腫瘤細胞中，TFR1 表達顯著增加，腫瘤細胞表面TFR1 與轉鐵蛋白的親和力是正常細胞的10～100 倍[14-15]。臨床試驗證明，膀胱移行細胞癌、乳腺癌、神經膠質瘤、肺腺癌、慢性淋巴細胞白血病、非霍奇金淋巴瘤中TFR1 表達情況與腫瘤分化程度、臨床分期及預后有關[16]。TFR1 的免疫組化染色已廣泛用于評估細胞的增殖率，并被認為在幾種類型的惡性腫瘤中具有評估預后的價值。Miller 等[17]研究674 例乳腺癌患者，發現TFR1基因表達與患者預后相關，TFR1 高表達提示預后不良。VEGF 是目前已證實的最有效、特異性最高的促進血管內皮生長的細胞因子，是檢測血管生成的關鍵標志物。腫瘤新生血管生成是多種類型惡性腫瘤的重要預后因素，研究表明，VEGF與骨肉瘤患者的腫瘤分期、分化程度和遠處轉移情況有關[18-19]。

本研究采用免疫組化染色法檢測兒童及青少年骨肉瘤患者中TFR1 和VEGF 的表達情況，結果發現，兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1 和VEGF 中高表達率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。提示TFR1 和VEGF 在兒童及青少年骨肉瘤的發生發展過程中可能發揮重要作用。進一步探討TFR1、VEGF 表達與兒童及青少年骨肉瘤患者臨床特征的關系，結果顯示，中低分化、有遠處轉移、Enneking 分期為Ⅱ～Ⅲ期兒童及青少年骨肉瘤患者骨肉瘤組織中TFR1、VEGF 中高表達率均高于高分化、無遠處轉移、Enneking 分期為Ⅰ期的患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。提示TFR1 和VEGF 在促進骨肉瘤進展、侵襲和轉移過程中具有一定的作用，可反映腫瘤的惡性程度。通過隨訪患者的生存情況發現，TFR1、VEGF 低表達兒童及青少年骨肉瘤患者的生存情況分別優于TFR1、VEGF 中高表達患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。提示TFR1、VEGF 表達情況與兒童及青少年骨肉瘤患者的生存情況有關，可能作為評估骨肉瘤患者預后的標志物，并可能為其治療提供新的靶點。本研究進一步分析兒童及青少年骨肉瘤患者中TFR1 和VEGF 表達的相關性，結果顯示，二者在骨肉瘤患者中的表達呈正相關（P﹤0.05），推測二者在骨肉瘤的發生、進展、侵襲和轉移過程中可能具有協同作用，但具體作用機制有待進一步探索。Zhu 等[20]根據腫瘤細胞高表達TFR 的特點，以與TFR 具有高親和力的T7 肽為導向，研制出靶向性納米載體，同時負載中藥化療增敏劑姜黃素和化療藥物多西他賽，證實了納米藥物不僅可通過協同效應發揮抗腫瘤作用，而且可通過對腫瘤免疫抑制性微環境進行正調控增強抗腫瘤效應。同時納米載體最大可能地減輕了常規化療藥物引起的骨髓抑制、器官功能受損等不良反應。

綜上所述，TFR1 和VEGF 在兒童及青少年骨肉瘤組織中表達上調，可能參與骨肉瘤的發生、發展、侵襲和遠處轉移，可作為骨肉瘤診斷、惡性程度判斷及預后評估指標，同時也可為兒童及青少年骨肉瘤患者的治療提供新思路、新靶點。