黑色素瘤相關抗原3、zeste 2 多梳抑制復合物2 亞基增強子在宮頸癌組織中的表達及與患者預后的關系

牛云霞，王越月，王雷

1陜西中醫藥大學第二附屬醫院病理科，陜西 咸陽 712000

2延安大學咸陽醫院病理科，陜西 咸陽 712000

宮頸癌是全球第三大女性生殖系統惡性腫瘤，具有較高的發病率和病死率。目前，晚期宮頸癌患者的中位生存期僅16 個月，嚴重影響患者的預后[1]。因此，晚期宮頸癌患者的治療重點是改善患者的預后，抑制腫瘤細胞的進一步侵襲、轉移。免疫治療是近年來新興的研究熱點之一，創傷小，易被醫師和患者接受。免疫靶點需要具有較高的特異性，即在正常組織中呈陰性或弱陽性表達，在腫瘤組織中呈陽性表達，從而避免治療后產生自身免疫性疾病[2]。隨著分子生物學的不斷發展完善，人們逐漸意識到宮頸癌是由多基因參與的癌變，因此，了解宮頸癌特異性抗原對腫瘤的監測、判斷至關重要，可為掌握腫瘤精準治療奠定基礎。研究發現，下調黑色素瘤相關抗原3（melanoma-associated antigen 3，MAGEA3）的表達可抑制腫瘤細胞的侵襲，表明MAGEA3 可促進腫瘤細胞的生長[3-4]。目前臨床已開展關于MAGEA3 免疫治療的臨床試驗，但僅局限在肺癌、膀胱癌等患者，對宮頸癌的研究較少。此外，zeste 2 多梳抑制復合物2 亞基增強子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）也被證實可增強肺癌細胞的增殖和轉移能力，但對宮頸癌發生發展的作用及與患者預后的關系仍未能完全明確。因此，本研究探討MAGEA3、EZH2 在宮頸癌組織中的表達及與患者預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年5 月至2016 年5 月陜西中醫藥大學第二附屬醫院收治的宮頸癌患者。納入標準：①符合《宮頸癌磁共振檢查及診斷規范專家共識》[5]中宮頸癌的診斷標準；②精神狀態良好；③既往未接受手術或化療；④病歷資料完整。排除標準：①繼發性宮頸癌；②隨訪資料不完整；③語言認知功能障礙，無正常溝通能力。依據納入和排除標準，本研究共納入45 例宮頸癌患者，年齡30～67 歲，平均（47.92±5.16）歲。選取同期陜西中醫藥大學第二附屬醫院收治的18 例宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者和17 例健康體檢者。CIN 患者年齡31～66 歲，平均（46.89±5.31）歲。健康體檢者年齡29～65歲，平均（47.43±4.92）歲。宮頸癌患者、CIN患者、健康體檢者年齡比較，差異無統計學意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組化法檢測MAGEA3、EZH2 的表達情況

取宮頸癌患者的宮頸癌組織、CIN 患者的CIN組織和健康體檢者的正常宮頸組織，切片、脫蠟、水化后，以0.01 mmol/L 枸櫞酸鹽溶液進行抗原修復13 min，冷卻至室溫后，滴加少量過氧化氫，以滅活過氧化物酶活性，山羊血清封閉，于室溫下孵育20 min，并用濾紙將表面殘余水分擦除。滴加一抗EZH2 多克隆抗體、MAGEA3 多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗，滴加生物素標記的二抗，37 ℃孵育30 min，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，梯度乙醇脫水，蘇木精復染，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

結果判定：MAGEA3、EZH2 主要定位于細胞核，依據染色強度和陽性細胞所占比例進行評分。無著色計0分，淡黃色染色計1分，棕色染色計2分，棕褐色染色計3 分；陽性細胞所占比例﹤25%計0分，陽性細胞所占比例25%～50%計1 分，陽性細胞所占比例51%～75%計2 分，陽性細胞所占比例﹥75%計3分。將染色強度評分和陽性細胞所占比例評分相乘，﹤3分判定為陰性，≥3分判定為陽性。

1.3 隨訪方法

采用電話或微信等方式對宮頸癌患者進行為期3 年的隨訪，隨訪時間截至2019 年5 月，記錄患者的生存情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 23.0 軟件對所有數據進行統計分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；MAGEA3、EZH2 表達的相關性采用Spearman 相關分析；宮頸癌患者預后的影響因素采用多因素Logistic 回歸分析；以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MAGEA3、EZH2 表達情況的比較

宮頸癌組織、CIN 組織和正常宮頸組織中MAGEA3、EZH2 的陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P﹤0.01），宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 的陽性表達率均高于正常宮頸組織和CIN 組織，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（表1）

表1 宮頸癌組織、CIN 組織和正常宮頸組織中MAGEA3、EZH2 表達情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征宮頸癌患者MAGEA3、EZH2 表達情況的比較

不同年齡、絕經狀態、腫瘤直徑、病理類型宮頸癌患者宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）；淋巴結轉移、肌層浸潤深度﹥1/2、臨床分期為ⅡA 期、組織學分級為G3級宮頸癌患者宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 的陽性表達率分別高于無淋巴結轉移、肌層浸潤深度≤1/2、臨床分期為Ⅰ期、組織學分級為G1～2級的患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征宮頸癌患者MAGEA3、EZH2 表達情況的比較

2.3 宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 表達的相關性

宮頸癌組織中MAGEA3 的表達與EZH2 的表達呈正相關（r=0.337，P﹤0.05）。

2.4 預后情況的比較

MAGEA3 陽性表達宮頸癌患者的3 年生存率為37.14%（13/35），低于陰性表達患者的80.00%（8/10），差異有統計學意義（χ2=4.147，P=0.042）；EZH2 陽性表達宮頸癌患者的3 年生存率為37.84%（14/37），低于陰性表達患者的75.00%（6/8），差異有統計學意義（χ2=4.679，P=0.031）。

2.5 宮頸癌患者預后影響因素的多因素分析

將2.2 中差異有統計學意義的淋巴結轉移情況、肌層浸潤深度、組織學分級、臨床分期作為自變量，宮頸癌患者的預后作為因變量，納入多因素Logistic 回歸分析，結果顯示，淋巴結轉移、肌層浸潤深度﹥1/2、臨床分期為ⅡA 期、組織學分級為G3級均是宮頸癌患者預后的獨立危險因素（P﹤0.05）。（表3）

表3 宮頸癌患者預后影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

宮頸癌主要由人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染引起，HPV 是一種可引起組織異常增生的小DNA 病毒，可在多種基因的作用下導致宮頸癌發生，且該過程漫長、復雜[6-7]。近年來，HPV 疫苗、宮頸癌的診斷已取得較大突破，臨床宮頸癌的治療主要采用手術、化療、放療或系統綜合治療。早期宮頸癌患者的治療效果較好，但對于持續性、晚期或復發性宮頸癌的治療效果較差。靶向治療作為一種新興的治療方式，可同時抑制多個癌基因的表達，具有高效、低毒的優勢，為免疫治療的發展開創了一條新道路[8-9]。此外，研發新的診斷手段、治療策略，對改善宮頸癌患者的預后有重要意義。

張晶晶等[10]對97 例宮頸癌患者的宮頸癌組織進行分析發現，MAGEA3 表達上調與腫瘤的發生發展有關。陳茜等[11]通過敲除人宮頸鱗狀細胞癌SiHa 細胞系中EZH2的表達發現，宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力顯著減弱。本研究結果顯示，宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 的陽性表達率均高于正常宮頸組織和CIN 組織（P﹤0.05），這可能與以下4個方面有關：①EZH2 可促進血管內皮生長因子分泌，從而改變微血管性質和密度，促進腫瘤的發生發展。②EZH2 可促進腫瘤生長因子Ki-67 的表達，從而促進腫瘤細胞轉移。③MAGEA3 可與p53結合，降低血細胞中p53 水平，從而使宮頸癌細胞更加活躍。④MAGEA3作為凋亡抑制基因，可降低腫瘤細胞凋亡率[12-13]。EZH2 在中樞神經系統中發揮監控發育調節因子的作用，糾正其不當表達，可確保神經系統發育正常。研究認為，EZH2是癌基因，可促進腫瘤的發生發展[14-15]，MAGEA3在多種腫瘤中發揮癌基因作用，MAGEA3 的表達情況可能影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡等生物學行為[16-17]。

本研究結果顯示，淋巴結轉移、肌層浸潤深度﹥1/2、臨床分期為ⅡA 期、組織學分級為G3級宮頸癌患者宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 的陽性表達率分別高于無淋巴結轉移、肌層浸潤深度≤1/2、臨床分期為Ⅰ期、組織學分級為G1～2級的患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。表明MAGEA3、EZH2均與腫瘤細胞的侵襲、轉移有關。研究顯示，腫瘤組織必須具備血管生成的條件，才可成功進行侵襲和轉移[18]。在肺癌、膀胱癌等腫瘤組織中，EZH2陽性表達率越高，腫瘤組織的新生血管網越豐富，說明EZH2過表達與腫瘤細胞的惡性生長和血管密度有關，是一種腫瘤微血管生成刺激因子[19]。

本研究結果中，宮頸癌組織中MAGEA3 的表達與EZH2 的表達呈正相關（r=0.337，P﹤0.05）。表明MAGEA3、EZH2 在腫瘤的發生發展中發揮了協同作用，通過共同建立新生血管網，增強了腫瘤細胞的侵襲和轉移能力，同樣的結論也適用于卵巢癌、胃癌等。李青等[20]研究顯示，沉默MAGEA3基因的表達可抑制宮頸細胞的惡變潛能，其作用可能涉及上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路的激活。成纖維細胞生長因子受體是首個被發現的促微血管生成因子，研究表明，MAGEA3 參與了成纖維細胞生長因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2）信號通路的構成[21]。MAGEA3 可促進腫瘤組織中FGRF2 的表達，使腫瘤微血管生成活躍，并通過調節纖維連接蛋白，參與腫瘤細胞的侵襲過程。雖然MAGEA3 及FGRF2 均通過影響腫瘤微新生血管生成來促進腫瘤細胞的持續生長和侵襲轉移，但具體機制仍未明確，仍需進一步探討。

未來的研究可進一步關注MAGEA3、EZH2 表達對淋巴結轉移的預測價值，為宮頸癌的臨床監測提供幫助。細胞表面包圍的MAGEA3 抗原，主要經組織相溶性復合體辨別結合，產生復合物后被宮頸癌細胞識別，進而提高腫瘤細胞的增殖能力；EZH2則通過參與DNA 甲基化抑制抑癌基因轉錄，二者在免疫療法治療宮頸癌中應用前景廣闊。本研究結果顯示，MAGEA3、EZH2 陽性表達宮頸癌患者的3 年生存率均低于陰性表達患者，提示MAGEA3、EZH2 檢測可為復發風險的預測提供有價值的信息。

綜上所述，MAGEA3、EZH2在宮頸癌組織中表達上調，且陽性表達患者預后較差，淋巴結轉移、肌層浸潤深度﹥1/2、臨床分期為ⅡA 期、組織學分級為G3級均是宮頸癌患者預后的獨立危險因素。