NOD 樣受體家族含CARD 結構域5 在胃癌中的相互作用蛋白及其對胃癌的診斷價值△

吳楊，張小敏，鄭少華

定州市人民醫院1腫瘤內科，2消化內科，河北 定州 073000

NOD 樣受體家族含CARD 結構域5（NOD-like receptor family CARD domain containing 5，NLRC5）的表達抑制可以顯著增強脂基糖（liposaccharide，LPS）刺激下核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路的活性以及細胞因子的表達量，而其自身也是NF-κB 通路的產物，被LPS 活化的NF-κB可以上調NLRC5 的表達，從而形成一個負反饋環，對NF-κB 活性進行更精細的調控[1-3]。胃癌發生的影響因素較多，包括遺傳因素、地域飲食文化因素、環境因素等，胃黏膜感染后產生的多種炎性因子可以激活NF-κB 通路，進而使多種細胞趨化因子上調，在胃癌的發展中發揮重要的作用[4]。雖然NLRC5 是NF-κB 信號通路的上游因子，但是否還有其他生物學通路參與NLRC5 的表達，目前無較多的研究報道。因此本研究應用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫和基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫探究與NLRC5 相關的調控通路，明確其在胃癌中的診斷價值和生物學特性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 生物信息分析（數據獲取與預處理）

TCGA（https://www.genome.gov/Funded- Programs-Projects/Cancer-Genome-Atlas）數據庫是由美國國家癌癥研究所設立的腫瘤樣本數據庫，旨在通過基因組分析尋找腫瘤相關的基因變異。根據本研究要求，利用“TCGAbiolinks”包下載TCGA 中胃癌樣本，細胞學分類只選擇腺癌樣本，防止由于細胞學分類不同帶來的影響，最終納入377 例腫瘤組織樣本和34 例癌旁組織樣本。

GEO 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是由美國國家生物技術信息中心建立并管理的生物信息公共數據庫。GEO 數據庫是全球最大且免費開放的數據庫，包含了各國科研人員收集上傳的測序數據和芯片數據，其涵蓋的疾病范圍不僅包含腫瘤疾病也包含非腫瘤疾病，物種從智人、小鼠、果蠅等擴展到微生物，是生物信息學研究的重要數據來源。根據本研究要求收集胃腺癌樣本數據集，最終鎖定數據集為GSE213324，數據集中包含63 例腫瘤組織樣本和60 例癌旁組織樣本。

本研究為了探討NLRC5基因對胃癌患者生存情況的影響，以TCGA 為發現集、GEO 為驗證集來評估NLRC5 在胃癌患者中的生物學作用。采用Wilcoxon 秩和檢驗比較NLRC5 在胃癌組織及癌旁組織間的表達差異，同時利用“limma”包篩選組間差異表達基因。利用“clusterProfiler”包對關鍵基因分別進行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，均以P﹤0.05 為判別標準篩選有意義的生物學途徑。以NLRC5 為研究中心，將其他基因分別與NLRC5 進行Pearson相關性分析來篩選與NLRC5 在表達量上存在協同變化的基因。若無特殊說明，利用R 軟件中的“ggplot2”對上述數據結果進行可視化展示。

1.2 一般資料

收集2020 年3 月至2022 年11 月于定州市人民醫院就診的胃癌患者的病歷資料。納入標準：①經影像學和病理學檢查確診為胃癌；②在定州市人民醫院就診及治療；③未接受過放化療、免疫治療；④臨床資料和隨訪資料完整。排除標準：①患有嚴重心腦血管疾病；②嚴重肝腎功能不全；③合并其他惡性腫瘤；④合并免疫系統或血液系統疾病。根據納入、排除標準，共納入60 例胃癌患者，男性48 例，女性12 例；平均年齡（68.09±7.15）歲；TNM 分期：Ⅰ期4 例，Ⅱ期23 例，Ⅲ期27 例，Ⅳ期6例。取60 例胃癌患者的60 例胃癌組織和60 例癌旁組織。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.3 方法

1.3.1 胃癌組織與癌旁組織的采集和處理 將病理檢查取樣的組織樣本分為兩部分，一部分在取樣后進行石蠟處理保存，一部分進行組織勻漿制備，置于-20 ℃下保存。

1.3.2 酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測核因子κB 激酶復合物抑制劑組分（component of inhibitor of nuclear factor kappa B kinase complex，CHUK）、核因子κB 激酶亞單位β的抑制劑（inhibitor of nuclear factor kappa B kinase subunit beta，IKBKB）在不同組織中的相對表達量 CHUK 蛋白檢測采用武漢云克隆科技股份有限公司保守螺旋環螺旋廣泛存在激酶（CHUK）檢測試劑盒。IKBKB 蛋白檢測采用武漢伊艾博科技股份有限公司核因子κB抑制蛋白激酶亞基β檢測試劑盒。使用制備好的胃癌組織以及癌旁組織勻漿根據試劑盒的說明書進行檢測。

1.3.3 免疫組化法檢測三重基序蛋白25（tripartite motif containing 25，TRIM25）、NLRC5 表達情況胃癌組織及癌旁組織石蠟塊進行4 μm 切片，運用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（streptavidin-peroxidase，SP）法檢測胃癌組織和癌旁組織中NLRC5、TRIM25 的表達情況，具體步驟根據SP 試劑盒進行操作。免疫組化結果由兩位副主任醫師及以上職稱的病理科醫師雙盲閱片，獨立評分。依據切片中陽性細胞所占比例和染色強度進行評分。染色強度：無色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。陽性細胞所占比例：無陽性細胞為0 分，1%≤陽性細胞所占比例﹤25%為1分，25%≤陽性細胞所占比例﹤50%為2 分，50%≤陽性細胞所占比例﹤75%為3 分，陽性細胞所占比例≥75%為4 分。將兩項得分相乘：0～3 分定義為“-”，4～5 分為“+”，6～7 分為“++”，≥8 分為“+++”；0～5 分為陰性，≥6 分為陽性。

1.4 統計學分析

采用SPSS 26.0 軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，評價TRIM25、IKBKB、CHUK、NLRC5 對胃癌的診斷價值；采用散點圖評估TRIM25、IKBKB、CHUK 與NLRC5 的相關性；以P﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 篩選NLRC5相關差異表達基因并進行富集分析

在TCGA 數據集中采用Wilcoxon 秩和檢驗比較NLRC5 在胃癌組織及癌旁組織間的表達差異，結果顯示，胃癌組織中NLRC5 表達水平明顯高于癌旁組織[（0.123±0.011）vs（0.008±0.003），P﹤0.01）]。組間差異基因分析以P﹤0.05 且|log2FC|﹥0.11 為標準共篩選出4466 個差異表達基因。將基因譜中的全部基因分別與NLRC5 進行關聯分析并進行富集分析，GO 富集分析結果顯示，生物學途徑中mRNA 和DNA 過程高度富集。KEGG 富集分析結果顯示，核質運輸和細胞周期也被高度富集（圖1）。因此得到NLRC5 涉及的相關顯著基因在胃癌發生發展過程中主要參與基因合成、mRNA相關功能。

圖1 GO富集分析和KEGG富集分析

2.2 構建蛋白-蛋白相互作用網絡

利用STRING 網站確定NLRC5 相互作用蛋白，根據蛋白-蛋白相互作用網絡可知，NLRC5 一共有29 條生物學關聯，共10 個基因與NLRC5有生物學相互作用。將這10個基因與TCGA數據庫篩選到的4466 個基因取交集，結果發現共有3 個基因，分別為TRIM25、CHUK、IKBKB，TRIM25、CHUK、IKBKB 與NLRC5 有生物學相互作用。胃癌組織與癌旁組織中TRIM25、CHUK、IKBKB 表達情況比較，差異均有統計學意義（P﹤0.05）（圖2）。Pearson 相關分析結果顯示，TRIM25、CHUK、IKBKB 與NLRC5 均呈正相關（P﹤0.01）（圖3）。

圖2 胃癌組織和癌旁組織中TRIM25、CHUK和IKBKB表達情況的比較

圖3 TRIM25、CHUK、IKBKB與NLRC5的相關性散點圖

2.3 GEO 數據集驗證結果

從GEO 數據集下載GSE213324 數據集來驗證TCGA 數據集篩選到的3 個基因。胃癌組織中TRIM25、IKBKB 和NLRC5 表達水平均明顯高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P﹤0.01）；胃癌組織和癌旁組織中CHUK 表達水平比較，差異無統計學意義（P﹥0.05）（圖4）。利用TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5 構建聯合診斷模型，繪制ROC 曲線量化聯合模型的診斷效能，結果顯示，TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5 聯合檢測對胃癌具有較高診斷價值（曲線下面積=0.920，95%CI：0.870～0.970）（圖5）。

圖4 GEO數據集中胃癌組織和癌旁組織中TRIM25、CHUK、IKBKB和NLRC5表達情況的比較

2.4 TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5 表達情況的比較

免疫組化結果顯示，NLRC5 在60 例胃癌組織中的陽性表達率為95.00%（57/60），陰性表達率為5.00%（3/60），在癌旁組織中的陽性表達率為41.67%（25/60），陰性表達率為58.33%（35/60）。TRIM25 在60 例胃癌組織中的陽性表達率為81.67%（49/60），陰性表達率為18.33%（11/60），在癌旁組織中的陽性表達率為41.67%（25/60），陰性表達率為58.33%（35/60）。胃癌組織中NLRC5、TRIM25 免疫組化評分均明顯高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。ELISA 檢測結果顯示，胃癌組織中CHUK、IKBKB 表達水平均明顯高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表1、圖6）

表1 胃癌組織和癌旁組織中IKBKB、CHUK、TRIM25、NLRC5 表達情況的比較

圖6 胃癌組織和癌旁組織中NLRC5和TRIM25表達情況（免疫組化染色，×400）

2.5 臨床模型中TRIM25、CHUK、IKBKB 與NLRC5 的相關性分析

Pearson 相關分析結果顯示，TRIM25、CHUK、IKBKB 與NLRC5 均呈正相關（P﹤0.01）。（圖7）

圖7 臨床模型中TRIM25、CHUK、IKBKB與NLRC5的相關性散點圖

2.6 TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5 聯合檢測對胃癌的診斷效能分析

ROC 曲線顯示，NLRC5[曲線下面積為0.872（95%CI：0.809～0.935）]診斷胃癌的效能優于TRIM25[ 曲線下面積為0.783（95%CI：0.697～0.869）]、CHUK[曲線下面積為0.755（95%CI：0.667～0.843）]、IKBKB[曲線下面積為0.771（95%CI：0.681～0.860）]。TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5聯合檢測[曲線下面積為0.946（95%CI：0.909～0.983）]診斷胃癌的效能優于各項指標單獨檢測，說明聯合模型對于胃癌具有良好的診斷效能，其中貢獻度最高的是NLRC5。（圖8）

圖8 臨床模型中TRIM25、CHUK、IKBKB和NLRC5單獨及聯合檢測診斷胃癌的ROC曲線

3 討論

NLRC5 是主要組織相容性復合體Ⅰ（major histocompatibility complex Ⅰ，MHCⅠ）類基因和參與MHCⅠ類抗原呈遞途徑的其他基因轉錄激活的關鍵調控因子。MHCⅠ類反式激活因子（MHC class Ⅰtransactivator，CITA）/NLRC5通過募集和激活殺死腫瘤的CD8+T細胞，在人類腫瘤免疫中起著至關重要的作用[5-6]。作為NLR 家族中的成員，NLRC5可通過調控炎性反應維持機體的穩定，而腫瘤的發生與炎性反應存在顯著關系[7-8]。有研究顯示，NLRC5基因多態性與胃癌的發病風險、TNM 分期、預后存在直接關聯[9]。徐徽等[10]研究也提示，NLRC5高表達是影響胃癌患者預后的危險因素，其研究重點在于NLRC5 與患者預后的關系以及胃癌細胞生物學，并未對NLRC5在胃癌診斷中的價值進行分析。已有研究表明，NLRC5 作為NF-κB 的上游因子可結合NF-κB 通路中的關鍵激酶IKKα/β并抑制其磷酸化，抑制NF-κB 通路的活化[11-12]。而蛋白存在多條調控通路，直接或者間接參與疾病的發展，探究是否還存在其他與NLRC5 相關的蛋白，共同調節NF-κB 的表達，來參與胃癌的發生或發展在臨床工作中至關重要，可為臨床中胃癌診斷與治療提供新的方向。

本研究通過采用TCGA 數據庫探究NLRC5 在胃癌組織和癌旁組織中的差異，結合STRING 網站分析NLRC5 的相互作用蛋白，通過GEO 數據庫驗證TCGA 數據集篩選出來的蛋白對胃癌的診斷價值，結果顯示，與NLRC5 互關作用的蛋白為TRIM25、CHUK、IKBKB，聯合診斷模型對胃癌具有較高的診斷價值。IKBKB編碼的蛋白質磷酸化抑制劑/NF-κB 復合物中的抑制劑，導致抑制劑解離和NF-κB 激活[13]。而NLRC5 主要作用于NF-κB通路中的關鍵激酶IKKα/β 并抑制其磷酸化。CHUK基因編碼的復合物IKKα是NF-κB 信號通路必要的調節器之一[14-15]。NLRC5 負調控NF-κB 通路的機制在于結合通路中的關鍵激酶IKKα/β并抑制其磷酸化，當磷酸化位點不能通過泛素化途徑觸發抑制劑的降解，則轉錄因子激活失敗。NF-κB通路活化失調后，NLRC5 負調控NF-κB 通路進而降低通路活化數量。CHUK 磷酸化通過泛素化途徑觸發抑制劑降解的位點，從而激活轉錄因子，而TRIM25 作為泛素E3 連接酶發揮作用，參與多種細胞過程，包括抗病毒先天免疫的調節[16]。綜上所述，TRIM25、CHUK、IKBKB 與NLRC5 在胃癌發展中存在直接或者間接相互作用的機制通路。

研究顯示，IKBKB 參與胃癌的發生、發展，并且IKBKB 高表達胃癌患者生存率和無病生存率均顯著低于IKBKB 低表達胃癌患者[17]，提示IKBKB有可能成為胃癌臨床診斷的新靶標，但未有此方面的研究。TRIM25 能影響胃癌細胞的遷移和侵襲，在胃癌發生和發展中起到重要作用[18]。而針對CHUK 的研究較少，目前在腫瘤方面尤其是胃癌處于空白。本研究通過引用臨床胃癌模型來驗證生物信息學篩選出來的相關作用蛋白，結果顯示，TRIM25、CHUK、IKBKB 和NLRC5 均在胃癌組織中高表達，且TRIM25、CHUK、IKBKB 與NLRC5 的表達均呈正相關，證實TRIM25、CHUK、IKBKB 是NLRC5 的相互作用蛋白。最后通過建立聯合診斷模型，繪制ROC 曲線量化聯合模型的診斷效能，結果顯示曲線下面積為0.946，95%CI 為0.909～0.983，說明TRIM25、CHUK、IKBKB 及NLRC5 聯合檢測對胃癌具有較高的診斷價值。

綜上所述，NLRC5 通過抑制TRIM25 的表達來降低對CHUK 產物IKKα的降解位點的觸發，減少NF-κB 的激活，而IKBKB 通過降解NLRC5 來增強NF-κB 的激活。NLRC5 高表達導致IKBKB 的直接性高表達，定向降解NLRC5 對NF-κB 激活抑制，因此探究抑制IKBKB 的表達，對NLRC5 在腫瘤發展中的作用至關重要。本研究的不足在于臨床驗證模型樣本量較少，沒有納入遺傳因素和地域飲食文化等因素，在后續的研究中需要繼續擴大樣本量，進行5 年的隨訪觀察。