氣相色譜–離子遷移譜分析微囊藻的揮發性成分

虞銳鵬　王怡淼　吳勝芳　宋啟軍　王嬋　周海權

摘要：建立頂空–氣相色譜–離子遷移譜（headspace-gas chromatography-ion mobility spectrometry，? HS-GC-IMS）方法，比較了不同生長時期的微囊藻揮發性物質差異。根據離子遷移譜圖結果，結合化學計量學方法對比揮發性有機化合物，通過其指紋譜圖觀察揮發性物質相對含量的變化規律。結果表明，揮發性成分的 GC-IMS 譜圖存在明顯差異，前 2 個主成分累計貢獻率達到 78.4%。從微囊藻水華樣品中共鑒定出 91 種揮發性成分，其中包括醛類 23 種、醇類 21 種、酯類 16 種、酮類 10 種、硫醚類 7 種、酸類 2 種、萜烯類 2 種，其中 1-丁醇、（E，E）–2，4–癸二烯醛、乙酸、二甲基硫醚、（E）–3–己烯–1–醇、 1–辛烯–3–酮等是微囊藻水華特征揮發性差異物。本方法操作簡便快速，靈敏度高，可用于藻類水華時揮發性代謝物的篩查及確證，為環境監測提供數據支持。

關鍵詞：氣相色譜–離子遷移譜；微囊藻；揮發性成分

中圖分類號：? R 994.4???????????? 文獻標志碼：?? A

Analysis of volatile components of Microcystis based on gas chromatography-ion mobility spectrometry

YU Ruipeng1，2，WANG Yimiao2，WU Shengfang2，SONG QiJun1，WANG Chan1，ZHOU Haiquan3

（1. School of Chemical and Material Engineering， Jiangnan University， Wuxi 214122， China;2. State Key Laboratory of FoodScience and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China;3. Zhejiang Beyondsun Green Energy Technology Co.， Ltd.，Huzhou 313008， China）

Abstract： Aheadspace-gaschromatography-ionmobilityspectrometry （HS-GC-IMS） methodwas established to compare the difference of volatile substances of Microcystis at different growth periods. Accordingtotheionmobilityspectrum，thevolatileorganiccompoundswerecomparedby using chemometrics. The change patterns in the relative content of volatile compounds were observed by its fingerprint spectrum. The results show that there is obvious distinction in GC-IMS spectrum of volatile components， with the cumulative contribution rate of first two principal components being 78.2%.91 volatilecomponentsareidentifiedfromMicrocystisbloomsamples，including 23 aldehydes， 21 alcohols， 16 esters， 10 ketones， 7 thioethers， 2 acids and 2 terpenes. Among them characteristic volatile componentsduring Microcystisbloominclude1-butanol， （E，E）-2，4-decadienal，aceticacid，dimethylsulfi-de， （E）-3-hexene-1-alcohol，1-octene-3-one. This method is simple， rapid and sensitive. It can be used as a screening and confirmation method of volatile metabolites in water during algal bloom， thus providing data support for environmental monitoring.

Keywords： gas chromatography-ion mobility spectrometry;Microcystis; volatile components

近年來，隨著快速城鎮化及過度的農業行為，湖泊富營養化加重，造成水體中藍藻異常生長，導致藍藻水華頻繁發生[1-2]。藻類死亡時將細胞內大量次生代謝物釋放到水中[3]，嚴重惡化水質，散發的異味引起人們對水質是否達標產生恐慌[4]。另一方面，藻類大量繁殖生長，會進一步消耗水體中的營養物質，從而誘導揮發性有機化合物（volatile organic compounds ，VOCs）大量產生與釋放[5]。這些 VOCs往往有利于藻類在激烈的競爭環境中生存和繁殖[6-7]，其主要為醛類、醇類、酯類、萜烯類和硫化合物[8]。藻類富含的甲硫氨酸可能是含硫 VOCs形成的前體物質，硫化物往往是藻華爆發期乃至死亡期常見的化合物，從水體擴散到大氣中后，進而影響空氣環境[9]。萜烯類 VOCs 具有化感抑制及幫助藻細胞抗逆脅迫作用，有效抑制其他水生生物生長[10]。如何將藻類生長繁殖過程中產生的揮發性代謝物同傳統水體表征指標相結合，建立合理評價指標及水華預測模型，需要深入探究。

揮發性有機物作為大氣重要污染物，受到環境監測領域的廣泛關注。目前對水體中 VOCs 的監測方法主要為嗅覺鑒定方法和儀器分析法，前者存在精密度較差、難以準確劃分異味類型等缺點。儀器分析法多采用三維熒光光譜、吸收光譜、氣相色譜法、氣質聯用法并結合微波蒸餾萃取法、吹掃捕集法、固相微萃取法等新型的前處理方法[11]，提高了定性定量分析效率。氣相色譜–離子遷移譜（ gaschromatography-ionmobility spectrometry， GC-IMS）方法利用氣相離子在電場遷移速率不同而對離子進行檢測，結合了氣相色譜高分離度和離子遷移譜高靈敏度的優勢，無需任何特殊的樣品前處理，即可快速檢測樣品中的痕量揮發性有機物。其結果以直觀可視化的指紋圖譜呈現不同樣品差異，目前已廣泛應用于食品品控[12]、醫療診斷[13-14]等領域。

藻類揮發性成分含量低、組成復雜、不穩定，現有的分離與檢測技術存在各自的局限，而采用 GC-IMS 方法對藻類揮發性風味成分的研究較少。本研究利用頂空–氣相色譜–離子遷移譜（ headspace-gaschromatography-ionmobility spectrometry， HS-GC-IMS）技術對藻類生長的不同階段產生的揮發性有機化合物進行檢測和分析，利用特征指紋圖譜分析微囊藻的衰亡過程，結合主成分分析及聚類分析等多元統計方法分析微囊藻衰亡初期的特異性化合物，探究該方法在水華預警指標細化及早期預警中應用的可行性。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

Eclipse E100生物顯微鏡（日本 NIKON 公司）；FlavourSpec風味分析儀（德國 GAS 公司）；TalboysVortex 渦旋混合器（美國 Henry Troemner公司）。

1.2 樣品前處理

藻樣收集及處理：2020年9月于太湖梅梁灣采集微囊藻水華藻水并室外培養，混合均勻后分配到鋁膜包裹的白色水桶內。實驗組水桶上方覆蓋白色透明薄膜。監測細胞密度，待其穩定后，每隔3 d 取樣：分為 Y1， Y2， Y2， Y4， Y5共5 個實驗組（后同），每組各取3只平行樣，迅速冷凍，?20℃保存。進樣前單獨解凍10 min 并充分混勻，恢復到室溫[11]。

1.3GC-IMS 測試方法

頂空進樣條件：分別稱取上述解凍后的樣品2.0 g 放于20 mL 頂空瓶內，在溫度60℃、轉速 u500 r/min 下培育30 min，在不分流進樣模式下于65℃進樣500μL。

GC-IMS 儀器條件： WAX 毛細管氣相色譜柱（30 m×0.53 mm×1μm，美國 RESTEK 公司），柱溫為60℃， 載氣為高純氮氣（純度≥99.999%），漂移氣載氣流速為150 mL/min，氣相載氣流速為初始2 mL/min，保持2 min ，在8 min 內線性增至 10 mL/min，之后在10 min 內線性增至100 mL/min，并保持20 min 不變，分析時間為40 min。

1.4 數據分析

使用儀器配套的VOCal分析軟件及 Reporter、 Gallery Plot 和 Dynamic 插件對樣品進行主成分分析（principal component analysis ，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等多元統計分析及含量分析。采用 GraphPad Prism 和OriginPro 2012b進行數據處理。通過自建的 IMS 數據庫、國家標準與技術研究院（ NationalInstituteofStandardsandTechnology， NIST）數據庫及保留指數對樣品中揮發性化合物進行分析，分析流程圖見圖1。

2 結果與討論

2.1 微囊藻揮發性成分的譜圖分析

選擇在9月份采樣是因為該時期微囊藻為水體優勢藻種，且氣溫、光照使藻生長達到高峰。室外培養條件模擬自然水體環境，當無額外營養物質的加入，微囊藻在較短時間內大量衰亡，容易發現差異明顯的揮發性代謝物。微囊藻生長過程中會消耗許多營養物質，產生 VOCs，實驗中后期微囊藻生長空間不足，溶解氧缺乏，微囊藻死亡加劇。5組實驗組（Y1～Y5）平均藻密度分別為1.48×10，6.35×10，9.54×10，1.40×10，6.44×107個/L，相對應的生長期為穩定期Ⅰ、穩定期Ⅱ、穩定期Ⅲ、衰亡期Ⅰ、衰亡期Ⅱ。使用 GC- IMS 對不同時期的微囊藻樣品進行分析，得到 VOCs 總峰體積（平均值）分別為：4.99×105，5.28×105，4.91×105，4.61×105，4.42×105，相關檢驗值 R =0.672，顯著性檢驗值 P 為0.0061。結果說明兩者存在中度正相關關系，且差異極顯著（P<0.01），這符合 Li 等[15]得出的結論，即微囊藻同其產生氣味具有相關性。探究其特異揮發性有機化合物，微囊藻不同生長階段（不同采樣時間節點）樣品圖片和揮發性有機化合物三維可視化圖譜如圖2所示。

利用 HS-GC-IMS 對不同生長時期的微囊藻樣品的揮發性化合物進行分析，探究影響微囊藻氣味的特異性揮發物質。IMS 檢測基于β電離產生的空氣簇離子與分析物發生快速離子反應，因此更適合用于痕量物質的分析檢測，該技術不僅可以準確鑒定樣品中的揮發性物質，還可以建立樣品的指紋圖譜[16]。圖2給出了微囊藻不同生長階段（不同采樣時間節點）揮發性有機化合物的可視化圖譜。其中，圖2（a）為三維譜圖，從圖中可以直觀看出不同樣品中的揮發性有機物種類和峰體積都有明顯不同，但是由于觀察不便，因此取俯視圖進行差異對比。

圖2（b）為不同生長時期的微囊藻樣品中揮發性化合物的二維譜圖。橫縱坐標分別為離子遷移時間和保留時間，反應離子峰（reaction ion peak， RIP）（1.0處）兩側的點代表揮發性有機物。其中，顏色代表物質的濃度，紅色到白色代表濃度逐漸降低。由圖2（b）可以看出，隨著微囊藻生長時期的變化，樣品揮發性化合物產生了明顯差異。為了能更直觀地比較不同生長時期的微囊藻揮發性物質之間的差異，以原漿 Y1的譜圖作為參考譜圖，利用軟件自帶的差異模式比較不同生長時期的微囊藻譜圖和參考譜圖之間的差異，結果如圖2（c）所示。紅色表明該化合物的濃度高于參考樣品，藍色則意味著該化合物的濃度低于參考樣品。從圖中可以看出，樣品組 Y2，Y3紅框中圈出的物質濃度高于對照樣品，而樣品組 Y4，Y5紅框中圈出的物質濃度明顯低于對照樣品，那么這些化合物可能成為鑒定不同生長時期的關鍵差異物。

2.2GC-IMS 揮發性成分定性及指紋圖譜分析

對不同生長時期的微囊藻樣品進行揮發性化合物定性分析，共檢測到155種化合物，利用 IMS 遷移時間數據庫和 NIST 庫共定性出115種揮發性化合物（包括單體和二聚體）。為了更直觀地比較微囊藻在生長過程中揮發性化合物的差異，利用軟件內置的 Gallery Plot 插件生成不同生長時期的微囊藻的 VOCs指紋圖譜，如圖3所示。橫坐標代表一個樣品中選取的全部信號峰（未標化合物名稱的由于所建 GC-IMS 數據庫不完善），縱坐標代表同一揮發性化合物在不同樣品中的信號峰。從圖中可以看出，不同生長時期的微囊藻特征揮發性物質有較大差別，包括醛類23種、醇類 21種、酯類16種、酮類10種、硫醚類7種、酸類2種、萜烯類2種。由于 GC-IMS 對醛酮類化合物檢測更為靈敏，因此能夠檢測到更多的醛酮類物質[17]。其中揮發性有機物較高的醛類有：丁醛、戊醛、壬醛、辛醛、庚醛、（E）–2–己烯醛–單體、（E）–2–辛烯醛-單體、2，4–癸二烯醛-單體；己醛、丙醛；酮類有：1–辛烯–3–酮、環己酮、丙酮、6–甲基–5–庚烯–2–酮、2–辛酮、2–戊酮、環己酮；含硫化合物有：二甲基硫醚、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、二烯丙基硫化物等。

藻類 VOCs 可自發產生， 也可為多種環境因素所誘導產生。光照、溫度、營養條件、鹽度等環境因子變化會導致藻類次生代謝途徑改變， 并誘導新 VOCs產生與釋放。微囊藻除釋放萜烯類、長鏈脂肪族烴、樟腦和β-紫羅蘭酮等化合物外，還釋放大量的芳香族和硫化物，藻類 VOCs 釋放到水體中后會改變水質 ， 如雜醇土味素具有泥土氣味，而己醛、辛醛、壬醛和1–辛烯–3–醇則帶有腥味。

2.3 微囊藻揮發性化合物 PCA 及 PLS-DA 分析

為驗證是否可以通過揮發性代謝物判斷微囊藻生長時期，研究對全部微囊藻樣品中鑒定出的揮發性化合物進行主成分分析，對不同生長時期的微囊藻樣品進行間差異性分析，結果如圖4（a）所示。從圖中可以看出第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為63.2%和15.2%，前兩個主成分的累計貢獻率達到78.4%，說明前兩個主成分就能獲取樣品的大部分信息。由圖4看出，相同生長時間的樣品有較好的聚集性，即穩定期Ⅰ、穩定期Ⅱ、穩定期Ⅲ較為接近，而與衰亡期Ⅰ、衰亡期Ⅱ差異較大，因此可以利用 GC-IMS 技術實現不同生長時期的微囊藻樣品的區分。

為了能夠將高維數據進行可視化降維處理，并且找出不同生長時期的微囊藻的特征化合物，基于上述揮發性物質建立 PLS-DA 模型，結果如圖4（b）所示。可以看出，5組樣品能夠被很好地區分開來，并且第一主成分和第二主成分的累計貢獻率達到81.3%，前兩個主成分能夠反映不同組別的樣品揮發性化合物的差異。一般地，對于 PLS-DA 模型可以用預測率 Q2和累積解釋能力參數 R2來判斷模型的預測性和解釋性。該模型的Q2和 R2分別為0.992和0.997，說明模型的擬合度和預測性都較好，可用于輔助差異物的篩選。此外，使用變量投影（variable influence on projection， VIP）值來確定對區分不同組別樣品有明顯影響的標志化合物，通常認為 VIP 值大于1時，該化合物就可以被認定為特征化合物。圖5列出了 VIP 值大于1.2的30種化合物，右側的方塊表示該化合物在不同生長時期的樣品中的濃度，藍色代表濃度最低，紅色代表濃度最高。具體信息如表1所示，包括化合物名稱、分子式、 CAS 號、遷移時間、保留時間和保留指數。

2.4 揮發性成分含量分析

在不同生長時期，微囊藻釋放各類揮發性化合物規律不同。對由 Gallery Plot 得到的指紋圖譜峰體積數據進行對比，直觀且定量地比較不同樣品之間的揮發性有機物差異，結果如圖6所示。隨著微囊藻的生長，1–丁醇濃度逐漸升高，見圖6（a）。二甲基硫醚來源于藻體滲透調節物質硫代甜菜堿的降解，藻類死亡后，硫代甜菜堿被硫代甜菜堿裂解酶分解或經光氧化降解為 DMS[18]。圖6（b）表明二甲基硫醚在微囊藻死亡后大量產生，在衰亡期Ⅱ濃度增至穩定期Ⅰ的8倍。藻受到外界威脅或損傷時會通過活化磷脂酶 A2釋放脂肪酸，再經脂氧合酶水解生成（E，E）–2，4–癸二烯醛用于防御[19]。由圖6（c）可以看出，（E，E）–2，4–癸二烯醛在穩定期保持在較高的水平，衰亡期則明顯下降。在穩定期末期檢測到較高水平的（E）–2–己烯醛，如圖6（d）所示，通常植物或微生物富含α–亞麻酸，其脂氧合酶途徑的代謝初產物是（Z）–3–己烯醛，此類揮發物質多源于高等植物，而因微囊藻中的脂氧合酶活性較低，少見于藻類[20]。在此研究中， GC-IMS 對醛類物質的高靈敏度得以體現。

實驗未檢測到脂肪族烴類， 可能是數據庫不全或靈敏度不高的緣故。 GC-IMS 技術在揮發性成分分析中存在的局限性尚需進一步完善。

3 結論

采用 GC-IMS 對不同生長時期的微囊藻揮發性氣味物質進行分析，共鑒定出91種揮發性成分，其中包括醛類23種、醇類21種、酯類16種、酮類10種、硫醚類7種、酸類2種、萜烯類2種。穩定期的初期時乙醇、二烯丙基硫醚、丙烯醛等物質的含量較高；穩定期的中期時1–辛烯–3–酮、（E，E）–2，4–癸二烯醛、（E）–2–己烯醛、異松油烯、冰片等物質的含量較高；衰亡期時1–丁醇、2–辛醇、氨、二甲基硫醚等物質的含量較高。不同生長時期的揮發性成分經 GC-IMS 檢測存在明顯的差異，通過 PLS-DA 可以很好地區分。本研究建立了不同時期微囊藻揮發性物質的指紋圖譜和可視化微囊藻揮發性物質的輪廓。本方法操作簡便快速，靈敏度高，穩定性好，可用于藻類水華爆發時水體中揮發性代謝物的篩查及確證，并為環境監測提供數據支持。

參考文獻：

[1] DOKULIL M T， TEUBNER K. Cyanobacterial dominance in lakes[J]. Hydrobiologia， 2000， 438（1/3）：1–12.

[2] YANGSB，CHENXL，LUJZ，etal. Impactsof agricultural topdressing practices on cyanobacterial bloom phenologyinanearlyeutrophicplateauLake，China[J]. Journal of Hydrology， 2021， 594：125952.

[3] SMITH G D， DOAN N T. Cyanobacterial metabolites with bioactivity against photosynthesis in cyanobacteria， algae and higher plants[J]. Journal of Applied Phycology， 1999， 11（4）：337–344.

[4] PILOTTOLS，DOUGLASRM，BURCHMD，etal. Healtheffectsof exposuretocyanobacteria （blue –green algae） duringrecreationalwater –relatedactivities[J]. AustralianandNewZealandJournalofPublicHealth， 1997， 21（6）：562–566.

[5] WATSON S B， MONIS P， BAKER P， et al. Biochemistry and genetics of taste- and odor-producing cyanobacteria[J]. Harmful Algae， 2016， 54：112–127.

[6] ZUOZJ，ZHUYR，BAIYL，etal. Volatile communication between Chlamydomonas reinhardtii cells under salt stress[J]. Biochemical Systematics and Ecology， 2012， 40：19–24.

[7] ZUO Z J， ZHU Y R， BAI Y L， et al. Acetic acid-induced programmedcelldeathandreleaseofvolatileorganic compoundsinChlamydomonasreinhardtii[J].Plant Physiology and Biochemistry， 2012， 51：175–184.

[8] WALSH K， JONES G J， DUNSTAN R H. Effect of high irradianceandirononvolatileodourcompoundsinthe cyanobacterium microcystis aeruginosa[J]. Phytochemistry， 1998， 49（5）：1227–1239.

[9]甘麗平， 徐慶歡，楊王庭， 等. NaNO3脅迫對兩種微囊藻 VOCs 釋放的影響 [J].水生生物學報 ， 2015， 39（4）：782–788.

[10] J?TTNER F， WATSONS B， VON ELERT E，et al.β- cyclocitral，agrazerdefencesignaluniquetothe cyanobacteriumMicrocystis[J].JournalofChemical Ecology， 2010， 36（12）：1387–1397.

[11]虞銳鵬， 王利平， 趙晨凱， 等.基于固相微萃取箭型-氣相色譜-質譜法測定銅綠微囊藻中揮發性代謝物[J].分析化學， 2020， 48（6）：750–756.

[12]謝玉芬， 張昆明， 楊文麗， 等.采用 GC-IMS 對4個薄荷品種不同組織部位揮發性物質的研究[J].食品與生物技術學報， 2021， 40（12）：88–98.

[13] VAUTZW，SEIFERTL，MOHAMMADIM，etal. Detectionofaxillaryperspirationmetabolitesusingion mobilityspectrometrycoupledtorapidgas chromatography[J].AnalyticalandBioanalytical Chemistry， 2020， 412（1）：223–232.

[14] DAURIZ M， MORICI N， GONZINI L， et al. Fifteen-year trends of cardiogenic shock and mortality inpatients with diabetes and acute coronary syndromes[J]. The American Journal of Medicine， 2020， 133（3）：331–339.

[15] LI X， YU J W， GUO Q Y， et al. Source-water odor during winter in the Yellow River area of China： occurrence and diagnosis[J].EnvironmentalPollution，2016，218：252–258.

[16] GARRIDO-DELGADO R， DEL MAR DOBAO-PRIETO M， ARCE L， et al. Determination of volatile compounds by GC-IMS to assign the quality of virgin olive oil[J]. Food Chemistry， 2015， 187：572–579.

[17] JIN J Y， ZHAO M Y， ZHANG N， et al. Stableisotope signaturesversusgaschromatography-ionmobility spectrometry to determine the geographical origin of Fujian Oolong tea （Camellia sinensis） samples[J]. European Food Research and Technology， 2020， 246（5）：955–964.

[18] MORAN M A， REISCH C R， KIENE R P， et al. Genomic insightsintobacterialDMSPtransformations[J]. Annual Review of Marine Science， 2012， 4：523–542.

[19] POHNERTG. PhospholipaseA2activitytriggersthe wound-activatedchemicaldefenseinthediatom Thalassiosirarotula[J]. PlantPhysiology， 2002， 129（1）：103–111.

[20] HATANAKAA. Thebiogenerationofgreenodourbygreen leaves[J]. Phytochemistry， 1993， 34（5）：1201–1218.

（編輯：董偉）