乳酸菌胞外多糖在畜牧業替抗中的應用前景

謝荔朋 閆 露 高俊帥 李兆龍＊

（1.福建九為生物技術有限公司 福建漳州 363900；2.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所 福州 350013）

乳酸菌（LAB）是一種能夠發酵碳水化合物并產生大量乳酸的微生物的總稱[1]。 它是一種具有悠久歷史的食品工業生產菌種，被廣泛用于發酵產品、肉制品、 醫療和保健產品中。 特別是在生產發酵乳制品，如乳酪和酸乳，對生產產品的質地、口味、風味和營養價值方面起著重要作用， 這些功能特性主要是通過乳酸菌分泌的次級代謝物胞外多糖來實現。

乳酸菌胞外多糖 （EPS） 是一種水溶性長鏈多糖，由發酵產生并分泌到胞外，分子量4.0×104～6.0×106u[2]。 它不僅具有獨特的物理和化學特性，可以改善發酵物的質地、口感、流變性、穩定性、持水能力和增強腸道表面的非特異性粘附性[3]。 同時，它也是一種具有生物活性的功能性多糖，具有抗菌、抗突變、抗腫瘤、調節免疫力、降低膽固醇和調節胃腸功能等多種保健作用，且自身無任何毒副作用[4-5]。 此外，近些年由于畜牧業中抗生素使用過量帶來的危害日趨嚴重，為了進一步減少抗生素危害，提高食品安全，國家出臺一系列減抗和替抗的條文和措施， 以促進畜牧業生產中的減抗和替抗。 作為乳酸菌代謝物胞外多糖，它的抗菌和抑菌效果，日益得到重視。 為了更全面了解乳酸菌代謝物胞外多糖在畜牧業生產中的作用及應用前景， 本文從乳酸菌代謝物胞外多糖結構、生理生化特點、功能以及它在畜牧業生產中的應用作較為完整的回顧， 以期推動乳酸菌代謝物胞外多糖在畜牧業生產中替抗的應用。

1 乳酸菌胞外多糖化學結構

1.1 根據分泌特點分類 根據乳酸菌分泌到菌體外特點，可將EPS 分為：分泌到細胞壁外的黏液多糖（SPS）和形成于粘附細菌表面的膠囊多糖（CPS 多糖）[4]。根據其合成部位和合成方式，EPS 可進一步分為：均聚糖和雜合多糖，其中均聚糖是由生物合成過程中的單糖組成，如甘露聚糖、右旋糖、果糖等；而雜合多糖是在細胞膜上生物合成過程產生的一個或多個結構相同的糖單位， 每個糖單位包含兩個或多個單糖，并且大部分糖單位都有分支[5-7]。 大多數乳酸菌產生的EPS 以雜合多糖為主。 此外，細菌外多糖（EPSs） 松散地結合在細胞表面或釋放到周圍環境中，其中一些酶和蛋白質參與了EPS 的生物合成[8]。離子或非離子EPS 是長鏈、高分子量水溶性天然聚合物，主要由糖單元組成，如葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、和一些糖的衍生物，例如N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰葡糖胺。 EPSs 在紡織品、粘合劑、美容學、食品添加劑、廢水處理和藥理學方面的應用有巨大的潛力。 細菌EPSs 的性質主要取決于菌株、培養基成分和培養條件。 不同的EPSs通常因單糖組成、電荷、單元之間的聯系、重復側鏈的存在和取代而不同[9]。

1.2 根據化學成分和生物合成機制分類 根據化學成分和生物合成機制，LAB 胞外多糖又被分為兩個不同的類別：同多糖（HoPS）和異多糖（HePS）[10]。LAB 的HoPS 是由一種單糖的重復單位組成，如D-葡萄糖或D-果糖，分子量105～106Da。 由葡聚糖酶和果聚糖酶形成的α-葡聚糖和β-果聚糖， 主要是在細胞外由單糖（果糖或葡萄糖）合成。 通過糖基水解酶（GH）的活性，在細胞外合成單糖（果糖或葡萄糖）供體蔗糖分子。 根據糖基類型、連接種類和涉及的碳的位置可將HoPS 分為α-D-葡聚糖[右旋糖（α-1,6）、Mutan （α-1,3）、Ruteran （α-1,4）、alternan（α-1,3、α-1,6）]，β-D-葡聚糖，果聚糖[levan（β-2,6、β-2,1）和菊粉（β-1,2、β-2,6）]，以及多聚半乳糖，由半乳糖的五聚體重復單元組成。許多不同主干結構、分支程度和連接點變化的HoPS（見圖1）都是由幾種LABs 菌株產生的[11]。

圖1 HoPS 的化學結構

1.3 根據來源及結構分類 根據來源可將ESP 分為同源細胞外多糖和異源細胞外多糖。 同源性胞外多糖分為四種類型：α-D-葡聚糖、β-D-葡聚糖、果糖和半乳糖。α-D-葡聚糖的代表包括右旋糖和普魯蘭；β-D-葡聚糖的代表包括可得然膠和硬葡聚糖。這些微生物多糖在糖苷連接、分支類型、聚合物鏈長度和高層結構方面具有顯著差異。 在乳酸菌同源多糖中，右旋糖是比較常見的，右旋糖的主鏈是由α-D-Glcp（1→6）和α-D-Glcp（1→3），這種特殊的化學結構使右旋糖酐具有獨特的物理特性[12]，它改善了產品的流變性能，增加了產品的黏度和穩定性，并在食品和醫藥等許多領域發揮著重要作用。 一般來說， 乳酸菌異源細胞外多糖骨架是由一個重復單元組成的單糖，如D-葡萄糖、D-半乳糖和L-鼠李糖。同源胞外多糖的化學結構，其中34 種具有獨特的結構[13]。與同源胞外多糖相比，異源胞外多糖的主鏈結構由細胞外多糖重復單元的主鏈及其分支組成，具有多樣性。少數異源細胞外多糖的重復單元含有N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺和葡萄糖。

2 乳酸菌胞外多糖的生物學功能

2.1 抗菌活性 EPS 的抗菌作用取決于它們的組成和結構。 據報道，分子量、組成和帶電基團與該活性特別相關。 高分子量的純化EPS 對革蘭氏陰性菌顯示出更強的抗菌作用， 而革蘭氏陽性菌則觀察到相反的趨勢[14]。 此外，EPS 組合物涉及與病原體的潛在相互作用。 BGSJ2-8 產生的EPS 與野生型菌株的組成不同， 表明野生型EPS 對于減少大腸桿菌與Caco-2 細胞的結合至關重要[15]。 有研究發現半乳糖對大腸桿菌的影響更大， 而葡萄糖醛酸對金黃色葡萄球菌的影響更大， 對幽門螺桿菌有更強的作用。EPS 的取代修飾包括磺化、 磷酸化和乙酰化會影響它們的抗微生物活性。 EPS 的硫酸化導致有效的抗菌活性，來自植物乳桿菌ZDY2013 和嗜熱鏈球菌的硫酸化EPS 對各種革蘭氏陽性菌表現出更大的抗菌作用[16]。

之前的體外和體內試驗證實，LAB 中各種EPS對多種病原微生物有明顯的抗菌活性。 其中抗菌作用方式一是間接通過刺激先天和適應性免疫反應，或通過促進其它有益的共生細菌或益生菌生物膜的生長和形成[17-19]。有研究發現腸系膜乳桿菌NTM048產生的右旋糖酐可刺激黏膜IgA 的分泌， 它刺激輔助T 細胞（Th1 和Th2）介導的反應，以及脾細胞中總的和抗原特異性IgA 的產生[20]。 而體內研究證明，來自發酵乳桿菌UCO-979C 的HePS 可通過調節胃先天免疫應答[21-22]，增加對幽門螺桿菌感染的抵抗力。

LAB-EPS 的抗菌活性也可以通過體內發揮作用：（1） 有助于LAB 在腸道定植中的益生元效應；（2）保護共生微生物免受宿主中的適應性免疫應答；（3）增強與病原菌的競爭[23]。盡管在實驗室中沒有更為詳細相關機制報道，但在小鼠模型中，有研究發現來自短雙歧桿菌UCC2003[24]的HEP 和來自枯草芽孢桿菌HMNig-2[25]的聚合物還可以直接促進抗微生物活性：（1）抑制病原微生物的生長；（2）干擾它們與腸上皮的粘附；（3）通過預防或減少病原菌形成生物膜。 如從植物乳桿菌WLPL04 產生的HePS 對病原菌（包括腸沙門氏菌血清型、鼠傷寒沙門氏菌[26]）、銅綠假單胞菌、大腸桿菌O157:H7 和金黃色葡萄球菌生物膜的形成有明顯抑制作用[27]。 植物乳桿菌NA-3 產生的EPS 對鼠傷寒沙門氏菌和蠟狀芽孢桿菌生物膜的破壞作用較為明顯[7]。 它的抗菌作用機制是LAB 的EPS 參與這些病原體表面形成生物膜的信號分子調控， 中斷它們的形成， 從而發揮抗菌作用[28]。

近幾年，關于EPS 抑制病原微生物的作用有較多報道， 有研究發現從人母乳中分離的產HePS 的鼠李糖乳桿菌， 在體外測定中顯示出對致病性大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的強抗菌活性[26]。類似地，由L.gasseri[29]和L.kefiranofaciensDN1[30]產生的HEP 已顯示出對幾種食源性病原體（例如單核細胞增生李斯特氏菌和腸炎沙門氏菌）的體外抗菌活性。 此外，在最近的一項研究中，從L.plajomiPW-7（以前稱為Lactobacillus plajomi）中提取的HePS 顯示出對幽門螺桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌活性[31]。關于EPS 對致病菌的潛在抑制機制，主要是通過破壞膜的完整性和釋放可溶性蛋白質來實現[32]。 實際上，通過電子顯微鏡證實了來自L.plajomiPW-7 的EPS 對一些革蘭氏陽性和革蘭氏陰性致病菌細胞膜的破壞[31]。Salachna 等[32]提出的另一種機制是EPS 可能促進次生代謝產物在生長培養基中的積累， 對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原體產生不利影響[32]。 細菌EPS 與細菌或真核細胞的相互作用結果表明，EPS 的抗菌作用主要是通過阻斷外膜的受體或通道而發生[33-34]。 生物膜是附著在表面的細胞外基質，由核酸、蛋白質、多糖和脂質的復合物組成。 包括致病菌在內的許多細菌通過產生生物膜， 對細胞外應激條件具有更強的抵抗力。在幾種致病微生物中，環境壓力可以觸發生物膜的形成， 從而增加粘附力和對宿主反應的保護。因此，生物膜在發病機制中發揮著重要作用[35]。 鼠傷寒沙門氏菌對雞胃腸道和輸卵管的定植主要是由于其粘附和形成生物膜的能力。 在雞上皮細胞系（Hep-2）中，已經表明某些EPS 有助于生物膜的形成[36]。

越來越多的科學證據支持這樣一種觀點， 即從實驗室提取的各種EPS 可以減少或抑制微生物生物膜，因此，它們在設計新策略以應對細菌生物膜相關感染和食品安全問題方面具有潛在的應用[37]。 研究表明，乳酸桿菌的許多EPS 可以干預生物膜的形成或分散病原體已經形成的生物膜。 嗜酸乳桿菌產生的EPS 已被證明可抑制多種病原體的生物膜形成，包括腸出血性大腸桿菌和腸炎沙門氏菌[38]。先前的研究表明， 植物乳桿菌YW32 和嗜酸乳桿菌A4的EPS 對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性病原體都具有抗生物膜活性[39-40]。 此外，發酵乳桿菌LB-69[41]和加氏乳桿菌FR4 的HePS 分別對蠟狀芽孢桿菌RSKK 863 和單核細胞增多乳桿菌表現出最高的生物膜抑制作用。據報道，乳酸菌產生的葡聚糖已被證明對白色念珠菌SC5314 具有抗生物膜活性[42]。從牛肉香腸中分離出的檸檬乳桿菌產生的右旋糖酐能夠破壞預先形成的生物膜，并抑制生物膜生成[43]。

有研究發現，EPS 可以通過修飾細菌外殼，從而阻礙細菌附著在表面，或者作為信號分子，調節參與生物膜形成的基因表達[44]。 有研究發現硫酸化EPS對多種革蘭氏陽性和陰性病原體的抑制作用比不含硫酸鹽的EPS 更強（見圖2）。 造成這種情況的一個可能原因是介導生物膜形成的信號中斷或水溶性蛋白質的流出途徑對細胞膜的損傷[29]。

圖2 胞外多糖的生物學功能

有研究發現LAB-EPS 有明顯的抗真菌活性[24]。產生EPS 的鼠李糖乳桿菌可能通過以下方式參與減少菌絲形成和降低念珠菌粘附：（1）共聚集；（2）免疫調節宿主上皮細胞；（3）競爭結合位點[41]。

LAB-EPS 對宿主病原體的干擾活性可以通過共聚集和降低病原體對腸上皮的吸附性能力來評估。 德氏乳桿菌亞種的菌株和保加利亞乳桿菌產生的EPS 可與大腸桿菌共聚集， 干擾大腸桿菌的活性[44]。 這種作用模式也已通過利用腸細胞系模型得到證實。 研究發現EPS 通過阻礙大腸桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌與上皮細胞HT29-MTX 的接觸，加強對宿主黏膜保護作用[45]。在另一項研究中，發現副干酪乳桿菌亞種產生的HEP8 參與上皮腸細胞的粘附并降低大腸桿菌與Caco-2 細胞的結合[46]。從人母乳中分離的產生HePS 的植物乳桿菌WLPL04 對大腸桿菌O157:H7 與人腸上皮細胞的粘附具有顯著的抑制作用[47]。 純化的HePS-WLPL04 在競爭、置換和抑制試驗中對大腸桿菌O157:H7 與HT-29 細胞的粘附具有相似的抑制作用[33]。有研究發現，約氏乳桿菌FI9785 產生的HePS 和α-葡聚糖可有效抑制家禽中產氣莢膜梭菌的定殖和持久性， 并減少小腸中大腸桿菌的定殖[48-49]。 通過疏水性和自聚集，由約氏乳桿菌FI9785 合成的EPS 可競爭性地抑制病原體[50]。

此外，EPS 還可以通過調節免疫系統對腸上皮中病原微生物引起的炎癥反應發揮拮抗作用。 豬腸上皮細胞系已被用于通過減弱產腸毒素大腸桿菌誘導的炎癥反應來確定產EPS 菌株如德氏乳桿菌TUA4408L 的拮抗作用[51]。

2.2 抗病毒作用 益生菌對人類和動物病毒的抗病毒活性是通過產生抑制性抗病毒化合物、 刺激免疫系統或與病毒直接相互作用等機制介導的[52-53]。根據所提出的機制， 這些作用可以被認為是：（1）局部或直接的，其中EPS 可以通過與病毒顆粒或宿主細胞相互作用阻斷病毒吸附來防止病毒感染[54]；（2）全身或間接的， 因為這些聚合物可以通過刺激宿主細胞的先天和適應性免疫來間接阻礙病毒[55]。

有研究表明，LAB 產生的EPS 誘導了系統和黏膜抗病毒反應的有益調節， 從而有助于降低病毒感染的嚴重程度。有研究報道，EPS 通過免疫調節天然和適應性反應以及干擾病毒顆粒的粘附或繁殖來促進抗病毒活性。 另一方面，一些研究表明EPS 可以直接對抗各種病毒性病原體[24]，如乳桿菌屬的EPS 26a 阻礙了5 型腺病毒（HAdV-5）的繁殖[42]，來自植物乳桿菌LRCC5310 的EPS 干擾了輪狀病毒在體外對細胞的附著。 此外，用EPS-LRCC5310 對年輕小鼠進行試驗， 使腸道和腹瀉期間輪狀病毒復制減少，從而縮短了小鼠的恢復時間[43]。

體內口服德氏乳桿菌OLL1073R-1 的HePS 發酵的酸奶和純化的HePS，導致流感病毒滴度顯著降低，抗流感病毒抗體（IgA、IgG1）顯著增加。 此外，在兩組接受治療的小鼠中，脾細胞的自然殺傷（NK）活性顯著增加[56]。 在豬腸上皮細胞（IEC）中，由Toll 樣受體3（TLR3）激活觸發的先天免疫反應受到來自德氏乳桿菌OLL1073R-1 的HePS 的不同調節。 EPS處理誘導豬IEC，通過用poly（I:C，病毒ds-RNA 的合成類似物）激活的TLR3 提高抗病毒活性，顯著增加了IFN-α、IFN-β 以及抗病毒因子黏液瘤病毒抗性A（MxA）和RNase L 基因的表達。 EPS 治療引起IL-6 和促炎趨化因子表達減少[57]。 在另一項體外研究中， 德氏乳桿菌TUA4408L 及其HePS 能夠通過減少病毒復制和調節炎癥反應來增強豬IEC 對輪狀病毒感染的抵抗力。 研究表明，TUA4408L 菌株及其EPS 通過激活TLR3 差異調節抗病毒先天免疫反應。 德氏乳桿菌TUA4408L 及其HePS 能夠刺激干擾素調節因子（IRF-3）和核因子kB（NF-kB）的信號通路，通過增加抗病毒因子干擾素（IFN）-β、MxA 和RNase L 的表達來增強免疫反應[58]。Mizuno 等[59]也發現了類似的結果，證明嗜熱鏈球菌ST538 的EPS 能夠調節由豬IEC 中TLR3 的激活觸發的先天性抗病毒免疫反應。 此外， 通過與不產生EPS 的突變株進行比較， 證實EPS 在ST538 EPS 株的免疫調節作用。

有研究發現，在鼻內感染流感病毒之前，對具有來自德氏乳桿菌OLL1073R-1 的中性或酸性EPS的小鼠進行口服給藥，酸性EPS 而非中性EPS 的治療延長了小鼠的生存期[56]。 而完整的EPS 分子對于在豬IEC 中獲得最高的免疫調節、抗病毒活性是必要的[57]。 另一方面，德氏乳桿菌TUA4408L 菌株的APS-EPS 和NPS-EPS 組分都能夠不同程度地激活免疫反應，盡管APS 組分參與了抗病毒免疫的調節[58]。 來自TUA4408L 的APS 和來自OLL1037R-1 的EPS 分別通過不同受體TLR4 和TLR2 的識別發揮作用，對先天抗病毒免疫誘導了幾乎相同的作用[58]。

免疫調節活性涉及分子水平的相互作用，EPS與酶和信號的結合過程取決于結構的立體特異性。然而，到目前為止，很少有研究將EPS 的單糖組成、官能團、 連接模式和微觀結構等因素與其免疫作用聯系起來[59-60]。 未來的體外和體內研究將有必要確定結構因素， 并闡明抗病毒免疫反應的潛在分子機制。深入研究生物活性聚合物的結構數據很重要，因為常用的分離程序可能會使產物與其它細菌成分共同沉淀，如脂蛋白或脂磷壁酸，這可能會刺激免疫反應[9]。此外，有足夠的科學證據表明，EPS 聚合物可能是疫苗的候選物；EPS 可以作為抗原載體，也可以作為抗原本身用于抗病毒治療， 以預防或治療人類和動物的病毒感染[24]。

3 乳酸菌胞外多糖在畜牧業中的應用前景

在過去幾十年中， 我國畜牧業生產為了追求經濟效益，使用大量抗生素，導致最近幾年環境污染、畜禽產品藥物殘留及耐藥菌株出現等問題越來越嚴重。為了減少畜牧業生產中抗生素的使用，我國密集出臺了減抗、替抗和禁抗的政策，其中在2020 年出臺了全面禁止抗生素在飼料中使用，又在2021 年和2022 年出臺了畜牧業生產中抗生素減量化使用的條文， 推動了我國畜牧業綠色健康發展。 政策的出臺，給畜牧行業帶來了陣痛，同時，由于國際形勢引起原料價格的動蕩和居高不下， 給畜牧業生產帶來生產效能低、 病死率增加等諸多問題。 禁抗和減抗的目標就是要找尋替抗物品， 以保證畜牧業健康生產。因此，開發抗生素替代品作為飼料添加劑以保證畜禽健康生長成為當前迫在眉睫的事。

之前的研究證實， 在仔豬日糧中添加乳酸菌EPS 能夠明顯下調仔豬IL-6、IL-8 及TNF-α 的表達和分泌，顯著增加仔豬防御肽的分泌表達[61-62]。 有研究發現EPS 還能增強仔豬腸上皮細胞防御功能并通過調節腸道菌群來增強腸道屏障作用。 而乳酸菌可以通過EPS 與腸上皮細胞的黏附定殖在腸道中，EPS 還可以促進乳酸菌生長，提高其抗逆性及益生潛力，并形成保護層幫助乳酸菌逃避免疫監測，促進腸道內乳酸菌的定殖， 同時還能降低腸道致病菌檸檬酸桿菌的定殖水平[63]。此外，有研究發現仔豬飼喂產EPS 的羅氏乳桿菌發酵的飼糧，可明顯降低斷乳仔豬回腸、 盲腸和結腸中產腸毒素大腸桿菌的定殖水平，有效緩解因腸道菌群平衡破壞導致的疾病。喂養羅伊氏乳桿菌和用羅伊氏乳桿菌發酵的小麥谷物， 證實胞外多糖對斷乳仔豬大腸絨毛高度和隱窩深度增加明顯[64]。

此外，有研究將EPS 添加到雛雞日糧中，發現EPS 能夠顯著提高腸道內乳酸菌的豐度， 并抑制常見腸道病原體如大腸桿菌、沙門氏菌等的增殖[65]。最近有研究發現家禽飼糧中添加非消化寡糖（NDO）的益生元， 包括市售的低聚果糖 （FOS）、 甘露聚糖（MOS）、半乳糖（GOS）、木低聚糖（XOS）、異寡糖（IMO）、β-葡聚糖和葡聚糖低聚糖（DOS）明顯促進肉雞的生長和增加腸道微生物群多樣性[66]。

4 小 結

乳酸菌胞外多糖有許多有益的功能，如抗菌、抗病毒、免疫調節、抗癌、抗氧化和調節腸道的微生態平衡等，尤其是它的抗病毒和抗菌功能，對當前畜牧業健康和綠色生產起到重要作用。它不產生耐藥性，無毒副作用，是減抗和替抗措施的最安全選擇，在當前畜牧業中有廣泛的應用前景。