不同種屬來源肝素組成與結構分析方法研究進展

劉晉仙,李瑋濤,,柳曉芳,王秀萍,張中志

(1.東營市食品藥品檢驗研究院,山東 東營 257091;2.東營天東制藥有限公司,山東 東營 257000)

肝素(Heparin)是一種帶有高密度負電荷的糖胺聚糖類化合物,產自動物結締組織型肥大細胞。肝素蛋白聚糖是由一條獨特的核心蛋白(絲甘蛋白)和與其共價連接的多條肝素多糖鏈組成。最終,肝素鏈在水解作用下斷裂形成分子量不同的較小肝素多糖(相對分子質量5 000～25 000)多分散混合物,儲存在肥大細胞的胞質分泌顆粒中[1]。臨床上主要用于預防和治療深靜脈血栓或肺栓塞(尤其與某些手術有關的栓塞)、防止血液透析等體外循環中血栓形成等。除抗凝活性外,肝素同時具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗瘧疾等功能。肝素分子結構極其復雜,是由不同分子量的線性多糖糖鏈組成的多分散性混合物。其活性成分肝素是由α-D-氨基葡萄糖(N-硫酸化,O-硫酸化或N-乙酰化)和O-硫酸化糖醛酸(α-L-艾杜糖醛酸或β-D-葡萄糖醛酸)組成的二糖重復單位以1-4糖苷鍵連接形成的線性多糖。迄今為止,人們仍未能對肝素的結構進行完全解析,更遑論人工合成。肝素可以從豬、牛、羊等動物的小腸黏膜和牛肺等組織中提取,但是不同來源的肝素化學結構和生物活性存在明顯的差異[2],其不良反應程度也不同。例如,相較于豬源肝素,牛源肝素引起血小板減少不良反應(heparin induced thrombocytopenia,HIT)的概率升高了1倍[3]。20世紀90年代源自歐洲的由朊病毒引起的牛海綿狀腦病(瘋牛病)以及同樣由朊病毒引起的羊癢病加劇了世界各國及其藥品監管機構對牛、羊來源肝素的擔憂。目前,在肝素產品的主要市場,如歐、美、中等,其藥典明確要求肝素及低分子肝素僅限來源自豬腸黏膜,不得混有其他來源肝素。中國是世界上第一大肝素供應國,占比超過50%。近年,特別是新冠肺炎疫情發生以來,由于肝素類產品作為抗凝藥物在新冠肺炎重癥患者的對癥治療中起到了一定作用,進一步使肝素價格飆升,甚至于肝素產業在一定程度上具有了資源類產業屬性。豬源粗品肝素的短缺和價格飆升造成了市場上粗品肝素良莠不齊,對于不同種屬來源的有效區分已經成為目前肝素產品質量控制的重要考量。因此,有必要對鑒別不同種屬來源肝素檢測方法的研究進展進行梳理,以便于保障廣大人民群眾的用藥安全。

1 肝素種屬來源的鑒別方法

目前,鑒別肝素不同種屬來源的方法主要分為兩類:一類是基于殘留核酸(DNA)、殘留蛋白的生化檢測方法,另一類是基于肝素結構的理化檢測方法。其中,生化檢測方法易受實驗環境、熟練程度、異物污染等影響。如肝素的提取、純化過程中使用的強堿、高溫等條件會導致DNA嚴重破壞,另外一些不良廠家會有意去除牛羊肝素中的DNA,同時肝素對聚合酶鏈式反應(PCR)有較強的抑制作用[4],導致PCR易出現假陰性,使針對核酸的PCR法失去效用;蛋白質釋放后很容易失活,特別是肝素的提取、純化過程中使用的強堿、高溫等條件更易導致蛋白質的破壞和變性,因此基于物種特異性蛋白的檢測方法也有很大的局限性。

近年來,基于肝素特征化學結構的檢測方法日益增多[5],相關檢測方法從肝素結構本身入手,不易受到干擾,重現性、穩定性都得到了保證。此類檢測方法的一個問題是使用的儀器一般較為昂貴,但隨著國內科學研究儀器的日益完備,這一問題也逐步得到了解決。

肝素糖鏈是由艾杜糖醛酸/葡萄糖醛酸與葡萄糖胺組成的二糖重復單位以1-4糖苷鍵連接形成的線性多糖。其中,糖醛酸C2位可發生硫酸化;葡萄糖胺的氨基位置可被乙酰化或硫酸化,C3和C6位可發生硫酸化。不同的硫酸化程度、不同的取代基位置形成了肝素復雜的不均一結構[6](見圖1)。對肝素進行結構解析主要有兩種策略(見圖2):自上而下(Top-down)、自下而上(Bottom-up)。Top-down方法中,肝素糖鏈不經過進一步降解,而直接進行檢測分析,如核磁(NMR)、紅外(IR)、分子排阻色譜法(SEC)、液質聯用法(LC-MS)等方法,從而獲得肝素中原始寡糖、單糖、特征結構等信息。Bottom-up方法中,肝素糖鏈首先經肝素酶(Ⅰ and/or Ⅱ and/or Ⅲ)或亞硝酸降解,然后經強陰離子交換高效液相色譜法(SAX-HPLC)、反相離子對液相色譜法(RPIP)、毛細管電泳法(CE)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、液質聯用法(LC-MS)等,對降解后的二糖、寡糖進行結構和含量分析,從而投射出肝素糖鏈的宏觀結構信息。

X=sulfo 或H,Y=sulfo,Ac或H

圖2 自上而下、自下而上分析策略

2 Top-down方法

Top-down分析方法以完整肝素糖鏈為直接分析對象,因此保留了糖鏈完整的信息,例如糖醛酸C5位差向異構信息。與Bottom-up方法相比,此種分析方法可以提供的肝素鈉糖鏈結構信息更為完整、豐富、精準。

Liu等[7]的工作報道了采用親水相互作用色譜-質譜法(HILIC-MS),在線分析對比依諾肝素鈉原研及仿制藥的全糖鏈結構信息。HILIC-MS方法可對糖鏈的N-乙酰化程度、還原端結構、非還原端結構等進行深度解析。Chen等[8]的工作中,使用類似的方法,在線分析對比依諾肝素鈉原研與羊來源肝素鈉制備的依諾肝素鈉之差異,發現羊來源肝素制備的依諾肝素鈉含有227種寡糖,而在原研Lovenox中鑒定出225種寡糖,兩者存在130種相同的寡糖,種類上有明顯差異。且這130種寡糖的具體含量也有明顯差異,如羊來源肝素制備的依諾肝素鈉,其硫酸化程度較高的寡糖[1,2,3,0,8],[1,4,5,0,12],[1,5,6,0,16],[1,5,6,0,17]和[1,6,7,0,17]含量較原研Lovenox多;其硫酸化程度較低的N-乙酰化寡糖[1,4,5,1,10],[1,4,5,1,11]和[1,4,5,1,12]含量較原研Lovenox多(寡糖組成信息通常采用[ΔHexA、HexA、GlcN、Ac、SO3]方式描述,其中ΔHexA代表寡糖鏈中不飽和糖醛酸、HexA代表糖醛酸、GlcN代表葡萄糖胺、Ac代表乙酰基、SO3代表磺酸基,數字代表各種結構的數量)。HILIC-MS方法以其良好的質譜兼容性,可對肝素類產品中含量極低的寡糖進行、發現和解析,近年來成為寡糖序列分析的重要手段。

Liang等[9]的工作中,介紹了一種對首先對糖鏈結構中醇羥基、胺基進行保護,然后使用LC-MS/MS方法,分析肝素/硫酸乙酰肝素中寡糖結構的方法。糖鏈羥基、胺基上硫酸取代基團在電離過程中易發生破壞,導致結構損失,限制了質譜方法在寡糖結構解析中的使用。該工作中,用氘代乙酸酐/丙酸酐取代糖鏈上不穩定的硫酸基團,得到的衍生化寡糖經C18色譜柱分離,聯用MS分析,可分析至十二糖,為鑒別不同來源肝素提供了一種可能的方法。

Guerrini等[10]的工作報道了通過結合1H和13C核磁共振譜圖,表征肝素生產、組成、硫酸基取代等信息,豬來源肝素與牛肺肝素在葡萄糖胺6位硫酸化取代程度(豬:81%～84%,牛59.3%～61.4%)、葡萄糖胺3位硫酸化取代程度(豬:5.1%～7.2%,牛1.4%～2.4%)、N-硫酸化(豬:78.2%,牛:89.6%)和N-乙酰化(豬:15.9%,牛8.7%)組分含量等方面有明顯差異。

Ange等[11]的工作報道了使用1H、13C、HSQC核磁共振譜圖,對來源自豬腸黏膜、牛腸黏膜、牛肺的肝素進行了對比,結果表明與豬腸黏膜肝素相比,牛腸黏膜肝素核磁氫譜中GlcNS的H1峰(5.23 ppm)明顯偏高,IdoA的H1峰(4.94 ppm)明顯偏低,GlcNY的H6峰(3.78 ppm)明顯偏高。牛肺肝素核磁氫譜中GlcNAc的甲基氫信號峰(1.95 ppm)明顯較低。

Mauri等[12]的工作中對于核磁氫譜的分析部分報道了類似于Ange工作的結論。該研究同時表明豬腸黏膜肝素與羊腸黏膜肝素核磁氫譜更為相似,兩者之間一個較為明顯的區別是羊腸黏膜肝素的GlcNAc的甲基氫信號峰低于豬腸黏膜肝素。該研究還根據核磁氫譜中GlcNY的H6峰(3.87 ppm)、GlcNS6X的H2峰(3.28 ppm)、GlcNAc的甲基氫信號峰(2.05 ppm)相互之間的比值關系給出了一種判斷肝素種屬來源的方法。Lucio Mauri的工作中對于HSQC譜圖的分析部分表明,來源自牛腸黏膜、豬腸黏膜、羊腸黏膜、牛肺的肝素在單糖組成上有較為明顯的差異,例如GlcNy6S(牛腸黏膜<其他來源),GlcA(豬腸黏膜>羊腸黏膜>牛肺),IdoA(豬腸黏膜>羊腸黏膜>牛肺)。

Monakhova等[13]的一項工作中通過核磁共振擴散排序譜(DOSY)可對粗品肝素中不同來源的不同分子量糖胺聚糖進行分析。

Monakhova等[14]的另一項工作中通過化學計量學方法對不同來源肝素核磁氫譜數據進行統計分析,進而鑒別其來源。應用主成分分析法(PCA),因子判別分析法(FDA)等可鑒別豬腸黏膜肝素中2%含量的羊腸黏膜肝素摻雜。該方法同樣適用于鑒別不同來源肝素制備的依諾肝素鈉。

Ouyang等[15]的工作中使用主成分分析法(PCA)對豬腸黏膜、牛腸黏膜、羊腸黏膜的核磁氫譜數據進行了統計分析,該方法可鑒別豬腸黏膜肝素中10%含量的牛腸黏膜或羊腸黏膜肝素。

3 Bottom-up方法

Bottom-up分析方法是首先將完整的肝素糖鏈降解為二糖、短鏈寡糖,以降解后二糖、短鏈寡糖的組分含量和結構為直接研究對象,得到二糖、短鏈寡糖的指紋圖譜,最后通過對降解后組分的鑒別分析、拼接,實現對糖鏈完整結構信息的分析、推測。

Watt等[16]的工作中對不同來源肝素降解后二糖含量百分比進行了分析。使用強陰離子交換樹脂柱對降解后樣品進行了分離、分析,結果表明,不同來源肝素具有不同的二糖組成。例如牛肝素△IIIS含量明顯高于羊肝素和豬肝素(見表1),與Top-down方法,核磁氫譜分析中GlcNY的H6峰(3.78 ppm)明顯偏高結果相對應。

表1 豬、羊、牛肝素二糖組成(%)

Ouyang等[15]的工作中對豬、牛、羊肝素及不同程度摻雜牛、羊肝素的豬肝素樣品,經肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ完全酶解后,通過反相離子對液相色譜法聯用質譜(RPIP LC-MS)檢測二糖;經肝素酶Ⅱ酶解后,通過RPIP LC-MS檢測不被肝素酶Ⅱ降解的四糖。RPIP使用揮發性的流動相,因而與MS有較好的兼容性,可以對經色譜法分離的二糖、寡糖組分進行更加靈敏的檢測和鑒別。應用主成分分析法(PCA)對檢測數據進行統計分析,結果表明該方法可有效區分不同來源肝素,用于豬肝素中牛、羊肝素摻雜的檢測。例如以不被肝素酶Ⅱ降解的四糖為對象分析,可鑒別豬肝素中10%含量的牛或羊肝素。

馬志華等[17]的工作中采用SAX-HPLC法對經肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ完全酶解后的豬、牛、羊粗品肝素的二糖組成進行了定量分析,并對摻雜有5%～25%牛或羊粗品肝素的豬來源粗品肝素進行了二糖定量分析。研究結果表明該方法可檢測出豬源粗品肝素中5%羊源粗品肝素摻雜,而對牛源粗品肝素摻雜不能很好地鑒別。

遲連利等[18-20]的工作中公開了一類通過分析待測樣品經肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ完全酶解后二糖、三糖組分,進而分析待測樣品中是否摻雜有反芻類動物肝素的方法。通過分析肝素待測樣品中全硫酸化三糖和△IA的比值,與豬源肝素標準品相應的數據對比,可以分析待測肝素樣品中是否摻雜有反芻類動物肝素;通過分析依諾肝素鈉待測樣品中單硫酸化三糖和還原端△IVS的比值,與豬源依諾肝素鈉標準品相應的數據對比,可以分析待測依諾肝素鈉樣品中是否摻雜有羊源依諾肝素鈉。該方法可以鑒別出豬肝素中10%羊肝素摻雜比例和5%牛肝素摻雜比例。

李瑋濤等[21]的工作中公開了一種通過分析待測樣品經肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ完全酶解后二糖組分,進而分析待測樣品中羊肝素摻雜比例的方法。通過分析肝素待測樣品中△IS和△IIIA的比值,可回歸計算出待測樣品中羊肝素摻雜比例。該方法可以鑒別出豬肝素中5%羊肝素摻雜比例。

Chen等[22]的工作中,經肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ完全酶解后的肝素樣品,使用二維液相與質譜聯用方法,先經強陰離子交換柱分離再經分子排阻色譜柱脫鹽,脫鹽后的組分可通過MS進行定性分析。通過此種方法,可以分離、定性酶解后樣品中存在的二糖、肝素酶耐受四糖、鏈接區等結構,并進行定量分析。EP肝素鈉標準品的IIS結構較ChP、USP高;對于鏈接區結構的含量各標準品又各有差異(ChP>USP>EP)。Zhu等[23]的工作中,肝素經肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ完全酶解后,經SAX-HPLC、SEC-MS方法,同樣大大提高了對肝素鈉糖鏈更為細致的分離和結構鑒定,例如對還原末端進行了較為充分的結構解析。這種組合策略結合了SAX方法的可靠性、分辨率和質譜的靈敏度、定性分析能力,為研究肝素質量和結構提供了強有力的工具,有望在區分肝素不同種屬來源和辨別豬肝素摻雜方面,發揮重要作用。

4 結語

肝素是臨床上廣泛應用的一種抗凝藥物,受限于豬腸黏膜來源肝素供應的緊張,市場上一直存在不法商家以其它來源肝素摻雜入豬腸黏膜肝素的行為,此舉一會損害正常合法的市場經濟運行規律,劣幣驅逐良幣;二會損害我國肝素產品、肝素生產廠家在國際上的信譽度[24];三最為嚴重的是摻雜肝素無充分的臨床應用經驗,若臨床上醫生按照豬腸黏膜來源肝素的使用方案使用的卻是摻雜肝素,可能引發嚴重的臨床事故,嚴重影響人民群眾的生命安全。本文簡要總結了近年來不同種屬來源肝素組成與結構分析方法的研究進展,期望能為肝素市場的規范性和保護人民群眾的健康做出點滴貢獻。