多波長HPLC-DAD法同時測定美白類化妝品中8種甘草化學成分

吳曉云,李思龍,刁飛燕,李啟艷,冉金鳳,劉春霖

(山東省食品藥品檢驗研究院,國家藥品監督管理局化妝品原料質量控制重點實驗室,山東 濟南 250101)

植物原料及其提取物由于安全性高、作用溫和等獨特的優勢,因此在化妝品行業有良好的開發和應用前景。甘草提取物主要包括黃酮類、三萜類和多糖類等活性成分,具有美白、防曬、抗氧化、抗炎和抗菌等功效[1-4],被廣泛應用于護膚類、美白類、防曬類等多種化妝品中。目前,涉及化妝品中甘草類化學成分的檢測標準有3個,國家標準《GB/T 35954-2018 化妝品中10種美白祛斑劑的測定高效液相色譜法》、行業標準《SN/T 1500-2004化妝品中甘草酸二鉀的檢測方法液相色譜法》與團體標準《T/CAFFCI 1-2018 化妝品用原料甘草酸二鉀》,且以上標準只涉及甘草酸二鉀的檢測。甘草提取物中除含甘草酸二鉀,還含有甘草苷、異甘草苷、甘草查爾酮B、甘草素、異甘草素、甘草查爾酮A和光甘草定等多種化學活性成分,本文建立多波長高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)法可同時測定以上8種甘草化學成分。

文獻報道甘草成分檢測方法有高效液相色譜法[5-6]、超高效液相色譜法[7]、液相色譜-質譜法等[8-10],主要涉及中藥材及其提取物研究。化妝品領域甘草化學成分的測定方法主要為高效液相色譜法[11-12],文獻[13]在237 nm波長下測定化妝品中的4種甘草成分,陸軍等[14]在237 nm波長下測定7種甘草成分。筆者未見文獻報道化妝品中甘草查爾酮B和異甘草素的測定,單一檢測波長很難兼顧每個組分的最佳檢測靈敏度,且同一提取方法可能不適用于多種復雜的化妝品基質。本方法在優化乳液類、膏霜類、水劑類和凝膠類4種基質前處理方法基礎上,建立多波長HPLC-DAD法同時測定8種甘草化學成分,該方法操作簡單、靈敏度和準確度高,為產品質量提供保障。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設備LC-40D高效液相色譜儀(日本島津公司),配DAD檢測器;Mettler Toledo MS電子天平(梅特勒-托利多國際貿易上海有限公司);Universal 320R高速離心機(德國Hettich公司);KQ-500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Milli-Q型超純水儀(美國密理博公司)。

1.2 材料與試劑乙腈、甲醇(色譜純,霍尼韋爾貿易上海有限公司);磷酸(優級純,國藥集團化學試劑有限公司);超純水。

標準品:甘草苷(批號:Z10J8X39611,含量98%,上海源葉生物科技有限公司);異甘草苷(批號:Y15A10H95344,含量98%,上海源葉生物科技有限公司);甘草查爾酮B(批號:W10S10Z96953,含量98%,上海源葉生物科技有限公司);甘草素(批號:T4890010,含量99.0%,上海安譜實驗科技股份有限公司);甘草酸二鉀(批號:F12M6Z1,含量98%,上海源葉生物科技有限公司);異甘草素(批號:38640010,含量99.9%,上海安譜實驗科技股份有限公司);甘草查爾酮A(批號:P21O8F46473,含量98%,上海源葉生物科技有限公司);光甘草定(批號:K27A9R59960,含量98%,上海源葉生物科技有限公司)。30批美白類化妝品均為市售產品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱:Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL·min-1;進樣體積:10 μL。流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脫(0～4 min,24%A;4～27 min,24%A →80%A;27～30 min,80%A →24%A;30～33 min,24%A)。檢測波長:231 nm(甘草苷、甘草素和光甘草定)、249 nm(甘草酸二鉀)、365 nm(異甘草苷、甘草查爾酮B、異甘草素、甘草查爾酮A)。

2.2 標準溶液的制備分別精密稱取甘草苷12.01 mg、異甘草苷10.65 mg、甘草查爾酮B 7.85 mg、甘草素9.50 mg、甘草酸二鉀12.04 mg、異甘草素10.19 mg、甘草查爾酮A 10.29 mg、光甘草定10.83 mg,置10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,配成標準儲備液。分別精密吸取上述標準儲備液各1.0 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋并定容至刻度作為混合標準溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 乳液類和膏霜類準確稱取0.5 g樣品(精確至0.000 1 g)于25 mL具塞比色管中,加入0.5 mL飽和氯化鈉水溶液,震蕩混勻,再加入10 mL 70%甲醇,渦旋混勻5 min后,超聲提取20 min,4 000 r·min-1離心4 min后,取上清液于比色管中,殘渣再加10 mL 70%甲醇重復上述步驟,合并兩次提取液,用氮氣吹干至5 mL左右,再加入甲醇溶解定容至10 mL,-18 ℃冷凍1 h后,4 ℃下6 000 r·min-1離心10 min,取上清液經0.45 μm濾膜過濾,取續濾液,即得。

2.3.2 水劑類和凝膠類準確稱取0.5 g樣品(精確至0.000 1 g)于10 mL具塞比色管中,加入適量70%甲醇溶液,渦旋混勻5 min至樣品完全分散,超聲提取20 min,冷卻后定容至10 mL,-18 ℃冷凍1 h后,4 ℃下6 000 r·min-1離心10 min,取上清液經0.45 μm濾膜過濾,取續濾液,即得。

2.4 系統適用性試驗精密量取“2.2”項下混合標準溶液1.0 mL置10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,將上述溶液按“2.1”項下色譜條件進樣。結果,在231 nm波長下8種成分分離度均大于2.5,達到基線分離,理論板數均大于7 000。

2.5 線性關系考察精密量取混合標準溶液適量,用甲醇分級稀釋,按照上述色譜條件分別進樣,以溶液濃度(X)為橫坐標,色譜峰面積(Y)為縱坐標,進行線性回歸。結果表明,8種成分在一定濃度范圍內線性關系良好,結果見表1。

表1 各成分的線性范圍、回歸方程和相關系數

2.6 回收率試驗取4種不同化妝品空白基質(水劑類、膏霜類、凝膠類和乳液類)各0.5 g,分別精密加入標準儲備液適量,使添加水平分別為低、中和高3個水平,每個水平平行制備3份樣品,按“2.3”項下制備供試品溶液后進樣測定,得到8種成分平均加樣回收率范圍為88.3%～96.2%,RSD為0.9%～3.5%,回收率良好,結果見表2。

表2 8種成分的平均回收率和RSD(n=3)

2.7 穩定性試驗取回收率試驗制備的低濃度供試品溶液(水劑類、膏霜類、凝膠類和乳液類),按上述色譜條件分別在0、2、4、6、12、24 h進樣分析,分別記錄8種成分峰面積,計算RSD在1.1%～2.0%之間(n=2),表明8種成分在24 h內穩定性良好。

2.8 精密度試驗取系統適用性試驗所制備的混合標準溶液,重復進樣6次,分別記錄8種待測物峰面積,計算RSD在0.7%～1.4%之間,表明儀器精密度良好,結果見表3。

表3 8種成分精密度考察

2.9 檢出限與定量限逐級稀釋標準溶液,把信噪比(S/N)為 3∶1時的濃度作為最低檢出濃度,信噪比(S/N)為10∶1時的濃度作為最低定量濃度,按稱取0.5 g樣品定容至10 mL進行計算,得到樣品檢出限和定量限,結果見表4。

表4 8種成分檢出限與定量限

2.10 樣品測定對30批美白類化妝品進行測定,4批樣品含甘草酸二鉀,含量在6.75～312 mg·kg-1之間;5批樣品含光甘草定,含量在1.93～23.9 mg·kg-1之間;其余6種成分未檢出。典型樣品色譜圖見圖1。混合標準品溶液色譜圖見圖1。

1.甘草苷;2.異甘草苷;3.甘草查爾酮B;4.甘草素;5.甘草酸二鉀;6.異甘草素;7.甘草查爾酮A;8.光甘草定

3 討論

3.1 檢測波長的選擇8種成分最大吸收波長有差異,用單一檢測波長,很難兼顧每個成分的最佳檢測靈敏度,故利用DAD檢測器的優點,設置多個波長進行檢測,使各成分均在最佳靈敏度下被檢測。試驗對8種化合物在190～400 nm全波長范圍掃描,在不考慮有較大干擾的末端吸收下,根據各成分的紫外吸收譜圖來確定檢測波長。結果表明:甘草苷在231 nm波長處有最大吸收、甘草素和光甘草定在231 nm波長附近有較強吸收,故選擇231 nm為檢測波長;甘草酸二鉀在249 nm波長處有最大吸收,故選擇249 nm為檢測波長;其余4種成分,異甘草苷在361 nm波長處有最大吸收,甘草查爾酮B在340～370 nm有最大吸收,異甘草素和甘草查爾酮A在360～380 nm有最大吸收,綜合考慮靈敏度及化妝品中防腐劑等基質的干擾,其余4種成分選擇365 nm為檢測波長。不同波長下8種成分的標準色譜圖見圖1。

3.2 流動相的選擇試驗考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相時8種成分在相同色譜條件下的分離效果。結果顯示,采用乙腈-0.1%磷酸溶液流動相進行分析時,基線平穩,分離度和峰形均較好,故選擇該流動相系統。考察不同梯度洗脫程序,結果顯示在最終確定的色譜條件下,8種成分在較短的洗脫時間內分離度良好。

3.3 色譜柱的選擇對比Phenomenex C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Kromasil 100-5-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)3種不同品牌色譜柱的分離效果。結果表明,使用Phenomenex C18柱,待測組分分離度均較好,分離時間較短且峰形良好,故選擇該色譜柱進行分析。

3.4 前處理方法的研究

3.4.1 提取溶劑的選擇本研究考察了甲醇濃度分別為90%、70%、50%、30%時,對4種不同基質樣品的提取效果。結果發現90%與70%甲醇的提取效率較高,由于70%甲醇提取的供試品溶液中干擾物質較少,且待測組分的峰形較好,故選用70%甲醇溶液作為提取溶劑。

乳液和膏霜類基質中,比較加入與不加入0.5 mL飽和氯化鈉水溶液,再進行超聲提取,結果顯示加入后提取效率顯著提高。由于先加入飽和氯化鈉水溶液,震蕩混勻使樣品變成流動狀態,樣品能夠完全分散利于待測成分的釋放,加速進入提取溶劑中。水劑和凝膠類基質加入飽和氯化鈉水溶液后的提取效率,與不加無顯著差異。

3.4.2 提取方式與時間的選擇以70%甲醇溶液作為提取溶劑,分別比較超聲提取(5、10、20、30 min)和震蕩提取(0.5、1、2、3 h)對同一樣品的提取效率。試驗結果表明,超聲提取優于振蕩提取;超聲提取20 min 時,各目標成分提取量最高,主要因為超聲提取利用超聲波產生的強烈震動及擴散效應,增加了溶劑穿透力,加速目標物擴散和溶解。最終試驗選用超聲提取20 min。

3.4.3 供試品溶液純化方式的選擇供試品溶液提取、濃縮與定容之后,再用0.45 μm濾膜過濾后進樣,樣品圖譜中干擾峰較多,背景噪聲干擾較大,且有些供試品溶液在靜置2 h后會析出絮狀沉淀。考慮到化妝品成分的復雜性,本研究采用低溫樣品純化,選擇將供試品溶液-18 ℃冷凍1 h,在低溫4 ℃下6 000 r·min-1離心10 min后過濾進樣,可以有效降低基質類成分的干擾。

3.5 結論本研究建立了多波長HPLC-DAD法同時測定化妝品中8種甘草化學成分的方法,方法學驗證結果表明該方法準確可靠、靈敏度高,適用于化妝品中8種甘草化學成分的分析及定量檢測,為化妝品原料和產品的監管提供技術支持。