睡蓮酚對小鼠酒精性肝損傷的保護作用

郭子雨,趙軍,姚雨含,李晨陽

(1.新疆大學生命科學與技術(shù)學院,新疆 烏魯木齊 830046;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所維吾爾藥重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830004)

酒精性肝損傷(alcoholic liver injury,ALI)是由于長期或大量飲酒所導致的肝臟細胞結(jié)構(gòu)異常和功能障礙性疾病[1-2]。若無有效的治療方法,ALI會進一步發(fā)展成為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化。近年來,ALI已成為肝臟損傷的第二大病因,僅次于病毒性肝炎[3-6]。睡蓮花(Nymphaeacandida)為睡蓮科睡蓮屬植物雪白睡蓮的干燥花蕾,具有清熱補心、濕腦安神、降熱養(yǎng)肝之功效,臨床用于心虛、肝虛以及熱性感冒等疾病的治療,是維吾爾抗肝炎復方制劑炎消迪娜爾糖漿的主要藥味之一。研究顯示,睡蓮酚(isostrictiniin)是該藥材的主要特征性化合物,對半乳糖胺、刀豆蛋白誘導的急性肝損傷以及四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化均顯示了較好的防治作用[7-11]。因此,本文通過小鼠急性ALI模型研究睡蓮酚對ALI的防治作用及其作用機制,以期可為睡蓮花的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物SPF級雄性昆明種小鼠72只,體重18～22 g,購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心:生產(chǎn)許可證號:SCXK(新)2018-0002,實驗動物使用許可證號:SCXK(新)2018-0002,倫理審查編號:IACUC-20220314-2。飼養(yǎng)條件:溫度22～23 ℃,濕度40%～50%,換氣良好,環(huán)境清潔,無外來傳染源,自由飲食和飲水。

1.1.2 主要試劑睡蓮酚(自制,純度98.7%);52°二鍋頭白酒(北京紅星股份有限公司);聯(lián)苯雙酯滴丸(Bifendate Pills,DDB;H11020980,北京協(xié)和藥廠);總超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、甘油三酯(TG)試劑盒(A001-3、 A003-1、A006-2-1、A110-2-1,南京建成科技有限公司);小鼠白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)Elissa試劑盒(JR18442D、JR20268D、 JL10484D,上海江來生物科技有限公司);油紅O和HE染色試劑盒(G1261、G1120,北京索萊寶公司);其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器Caris 200全自動化學發(fā)光免疫分析儀(廈門優(yōu)邁科醫(yī)學儀器);Varioskan Flash酶標儀(美國賽默飛世爾科技公司);HZQ-C全濕恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科學儀器有限公司);HC-3018R高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司);KDC-2046低速冷凍離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理小鼠ALI造模參照文獻[12]方法。將健康雄性昆明小鼠72只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,根據(jù)體重隨機分為正常組、模型組、陽性對照聯(lián)苯雙酯組(DDB,63 mg·kg-1)和睡蓮酚低中高劑量組(25、50、100 mg·kg-1),每組12只。每天按設(shè)定劑量灌胃給藥,正常組和模型組灌胃給予等量蒸餾水。每次給藥2 h后,除正常組外,其余各組小鼠灌胃給予52°白酒(13 mL·kg-1),連續(xù)7 d。末次給藥并禁食16 h后,摘眼球取血,靜置后,3 000 r·min-1離心20 min,分離血清,凍存于-80 ℃ 冰箱待檢。頸椎脫臼處死小鼠,摘取肝臟,稱重,計算肝臟指數(shù):肝臟指數(shù)(mg·g-1)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。將部分肝組織以預冷生理鹽水沖洗,置于4%多聚甲醛中固定,用于病理學觀察;再以錫箔紙包裹剩余肝臟放入液氮中速凍后放入-80 ℃冰箱待測。

1.2.2 血清生化指標的測定采用全自動生化儀檢測小鼠血清ALT、AST、TG和TC含量。

1.2.3 肝組織生化指標的測定精密稱取小鼠肝組織,按照重量體積比加入9倍體積的生理鹽水,剪碎組織,冰水浴中制備勻漿,3 500 r·min-1,離心10 min,取上清液按照試劑盒說明,測定小鼠肝組織MDA、GSH、SOD、TNF-α、IL-6、IL-1β及TG水平。

1.2.4 病理組織學檢查常規(guī)石蠟包埋,切片,進行HE及油紅O染色,在光鏡下觀察肝組織病理學變化。

1.2.5 RT-PCR檢測Keap1、Nrf2、NQO1的mRNA表達以離心柱法抽提肝臟組織中的總RNA。在冰上配制體系進行反轉(zhuǎn)錄實驗,以實時熒光定量PCR考察mRNA的表達量。

表1 RT-PCR引物序列組成

2 結(jié)果與分析

2.1 睡蓮酚對ALI小鼠血清AST、ALT水平及肝臟指數(shù)的影響在試驗過程中,正常對照組小鼠生長狀況良好,食欲旺盛,毛發(fā)光澤,未發(fā)生死亡;而模型組小鼠隨著造模時間延長,小鼠口唇發(fā)紺,糞便干硬偏黃,小鼠食量減少,體形消瘦,且死亡4只,說明酒精對小鼠產(chǎn)生嚴重的損傷,造模成功。此外,在試驗期間,聯(lián)苯雙酯組小鼠死亡1只,睡蓮酚中高劑量組各死亡2只,其低劑量組死亡3只;死亡原因同模型組。如圖1所示,模型組小鼠的肝臟系數(shù)明顯高于正常對照組(P<0.05),說明小鼠攝入酒精后出現(xiàn)肝臟腫大。睡蓮酚中、高劑量組(50、100 mg·kg-1)能明顯降低酒精升高的肝臟系數(shù)(P<0.05)。與正常對照組相比較,模型組小鼠血清ALT、AST含量明顯增加(P<0.01),分別升高了81.9%、51.6%,說明酒精造成了肝細胞損傷。與模型組相比,睡蓮酚高劑量組(100 mg·kg-1)能明顯降低小鼠血清ALT活性(P<0.01)。結(jié)果表明睡蓮酚具有改善肝功能的作用,能夠減輕酒精所誘導的肝損傷。

圖1 睡蓮酚對ALI小鼠血清ALT、AST以及肝臟系數(shù)的影響

2.2 睡蓮酚對ALI小鼠血清TG和TC水平及肝組織TG水平的影響由圖2所示,與正常組相比,模型組小鼠血清TG、TC水平以及肝組織TG水平顯著升高(P<0.01),說明大量酒精攝入導致肝組織及血液中的脂肪含量增加。與模型組相比,睡蓮酚中、高劑量組(50、100 mg·kg-1)均能使小鼠血清TG、TC含量及肝組織TG含量顯著下降(P<0.01),且呈現(xiàn)出了劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。結(jié)果表明睡蓮酚可以降低血液中的脂肪含量,具有較好的抗脂肪變性和脂肪沉積作用,可以防治酒精性脂肪肝的發(fā)生。

圖2 睡蓮酚對ALI小鼠血清TG、TC及肝組織TG水平的影響

2.3 睡蓮酚對ALI小鼠肝組織MDA、GSH、SOD水平的影響如圖3所示,與正常組相比,模型組小鼠肝組織中MDA含量明顯增加(P<0.01),說明酒精導致的脂質(zhì)過氧化,損傷了肝細胞。睡蓮酚低、中、高劑量組(25、50、100 mg·kg-1)能顯著降低酒精損傷致小鼠肝組織MDA的升高(P<0.01)。與正常組相比,模型組小鼠肝組織GSH和SOD活性顯著降低(P<0.01),說明酒精導致的氧化損傷加快了抗氧化物質(zhì)的消耗。與模型組相比,睡蓮酚低、中、高劑量組(25、50、100 mg·kg-1)小鼠肝組織GSH和SOD活性明顯升高(P<0.01)。結(jié)果說明睡蓮酚可通過抑制肝細胞脂質(zhì)過氧化以及提高抗氧化物水平減輕酒精誘導的肝損傷。

圖3 睡蓮酚對ALI小鼠肝組織GSH、MDA、SOD水平的影響

2.4 睡蓮酚對ALI小鼠肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響由圖4可見,與正常組相比較,模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著增加(P<0.01),差異具有統(tǒng)計學意義。與模型組相比,睡蓮酚中、高劑量組(50、100 mg·kg-1)均能明顯降低小鼠肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果表明,睡蓮酚可通過促炎細胞因子的調(diào)控發(fā)揮肝保護的作用。

圖4 睡蓮酚對ALI小鼠肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響

2.5 睡蓮酚對ALI小鼠肝組織病理學的影響HE染色結(jié)果見圖5,正常肝細胞邊界清晰有序,細胞核和靜脈毛細血管結(jié)構(gòu)清晰,未見炎性細胞浸潤和體細胞轉(zhuǎn)化。模型組小鼠肝組織有顯著改變,肝細胞變大,排列不整齊,而且有不規(guī)則脂肪空泡產(chǎn)生,肝血竇充血和炎性細胞浸潤。與模型相比,睡蓮酚劑量組的小鼠肝組織病理損傷均得到不同程度的改善,且有顯著的劑量-效應(yīng)趨勢。睡蓮酚低劑量組與模型組小鼠相近,但肝細胞腫脹和體細胞之間的邊界仍然存在,而中、高劑量組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)較為正常,雖可見散在脂滴,但細胞間有著清晰的界限,不規(guī)則脂肪空泡減少,未見明顯炎癥。

A.HE染色;B.油紅O染色

油紅O染色結(jié)果與HE染色結(jié)果是相同的,在模型組小鼠肝細胞中,可以看到很多紅色脂滴,聯(lián)苯雙酯組和各劑量睡蓮酚組紅色脂滴下降顯著,而且睡蓮酚組均呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)趨勢,聯(lián)苯雙酯組與睡蓮酚高劑量組程度相近。

2.6 RT-PCR法檢測ALI小鼠肝臟組織Keap1、Nrf2和NQO1的mRNA表達如表2所示,與正常組比較,模型組小鼠肝組織Nrf2、NQO1 mRNA的表達顯著減弱(P<0.01),Keap1顯著增強(P<0.01),說明酒精灌胃促進了Keap1/Nrf2信號通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,提示酒精肝損傷可能與其激活Keap1信號通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)。與模型組比較,睡蓮酚低、中、高劑量組(25、50、100 mg·kg-1)小鼠肝組織中Nrf2、NQO1 mRNA的表達水平顯著增強(P<0.05,P<0.01),Keap1顯著降低(P<0.01),提示受試藥物及聯(lián)苯雙酯對肝損傷小鼠的保護作用,可能是通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2通路實現(xiàn)的。

表2 睡蓮酚對ALI小鼠肝組織Keap1、Nrf2、NQO1 mRNA表達水平的影響

3 討論

酒精性肝損傷的發(fā)病機制非常復雜,多種途徑參與其中,但氧化應(yīng)激已被認為在酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。當肝臟功能不全或是大量飲酒時,超過機體的代謝能力,乙醇氧化分解的速度變慢,則容易發(fā)生肝臟損傷。酒精的過量飲用可抑制肝組織中GSH及SOD等抗氧化酶的合成,同時會導致H2O2、·OH等自由基的大量產(chǎn)生,引起脂肪過氧化,產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),導致肝細胞損傷,AST、ALT和MDA水平升高。作為脂肪代謝及檢測脂肪氧化的重要指標,在酒精引起的肝損傷中,TG、TC水平也顯著增加。睡蓮酚能降低AST、ALT、TG、TC水平及肝組織MDA水平,說明睡蓮酚確有明顯的保肝降酶作用(TG、TC是血脂指標)。

細胞因子代謝異常是ALI的一個主要特征,在ALI發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用。ALI小鼠的血清中,促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β顯著升高,這些因子的表達水平與疾病的嚴重程度相關(guān)[13]。睡蓮酚給藥后,TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯降低,顯示睡蓮酚通過抗炎活性發(fā)揮肝保護作用。病理學觀察也證實了這一點。

氧化應(yīng)激通路中的相關(guān)蛋白Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子,誘導各種氧化應(yīng)激反應(yīng)中下游基因的編碼解毒酶和抗氧化蛋白[14]。生理狀態(tài)下,Nrf2與Keap1結(jié)合,其活性受到抑制。酒精刺激引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)導致Keap1和Nrf2分離,Nrf2解離后進入細胞核,與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后,再與抗氧化反應(yīng)原件(ARE)結(jié)合,啟動超醌氧化還原酶1(NQO1)等下游基因的轉(zhuǎn)錄與表達,從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷作用[15-16]。實驗結(jié)果顯示,經(jīng)睡蓮酚預防性給藥后,Nrf2和NQO1 mRNA表達較模型組顯著上升,抗氧化通路被激活,加速了自由基的清除,改善了氧化應(yīng)激引起的肝損傷。以上研究結(jié)果說明,睡蓮酚對ALI確有較好的防治作用,其機制與Keap1/Nrf2抗氧化通路的激活、促炎因子的調(diào)控相關(guān)。