巴多昔芬治療小鼠膠原誘導性關節炎的療效及對滑膜成纖維細胞的影響

張瑩,代春燕,田靜,田吉來

(1.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院風濕免疫科,江蘇 南京 210008;2.夏津縣人民醫院內分泌腎病科,山東 德州 253200;3.南京中醫藥大學醫學院·整合醫學學院生物化學與分子生物學系,江蘇 南京 210023)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種主要累及外周關節的自身免疫性疾病,早期主要表現為關節晨僵疼痛,若疾病不能有效控制,最終導致關節畸形、關節毀損,甚至致殘。盡管目前RA 治療方面取得很大進展,但仍有部分患者未能達到臨床緩解。RA 的主要病變在關節,表現為滑膜炎、滑膜增生、血管翳形成、軟骨和骨破壞。滑膜成纖維細胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)是關節滑膜襯里層的重要細胞成分。RA患者FLSs獲得過度增殖、遷移和侵襲表型,是滑膜炎和血管翳形成的主要原因,是介導炎癥和骨破壞的“罪魁禍首”[1]。目前臨床上針對FLS的治療方法有限[2-3]。

FLS主動參與RA關節局部的免疫炎癥,是分泌白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的主要細胞。IL-6與其特異性受體(IL-6R)結合,進而招募糖蛋白130(gp130),三者形成有活性的IL-6/IL-6R/gp130三元六聚體復合物,激活下游通路,如信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)的高度磷酸化,促進細胞增殖和侵襲[4]。針對IL-6R單抗或受體融合蛋白已成為臨床治療RA的重要藥物[5]。

選擇性雌激素受體調節劑(selective estrogen receptor modulator,SERM)巴多昔芬(bazedoxifene,BAZ)被再定義為IL-6/gp130抑制劑已被廣泛認可[6]:其吲哚部分和七元氮雜環擬似IL-6的Trp157和Leu57基團,可有效結合gp130的D1區域(見圖1),從而發揮拮抗IL-6的作用[7-8]。本文擬采用小鼠膠原誘導性關節炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型,評估BAZ對CIA小鼠的治療作用,細胞水平評估BAZ對滑膜成纖維細胞MH7A增殖、侵襲遷移的影響,探討BAZ靶向gp130是否有可能成為治療RA的新藥。

左為BAZ的化學結構式;右為吲哚部分和七元氮雜環分別模擬IL-6的Trp157和Leu57和gp130的D1區域進行有效結合

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞DBA/1小鼠(雄性,8周)購自中國上海SLAC實驗室動物有限公司[動物使用許可證號:SYXK(蘇)2014-0052],并在南京鼓樓醫院實驗動物中心的無特定病原體(specific-pathogen-free,SPF)條件下飼養,飼養環境室溫度24～27 ℃,濕度50%,水食自由,12 h交替光照。所有動物實驗均在南京鼓樓醫院動物研究倫理委員會批準的規程下進行(批準編號:2019AE01044)。

A.動物實驗的免疫和藥物干預的時間安排;B.CIA小鼠在開始免疫后不同天數下的AI評分(n=6);C.第57天小鼠后足外觀的代表圖;D.CIA小鼠在開始免疫后不同天數下的后肢足厚度(n=12)(Mean±SD,*P<0.05)

A.H-E和SO-FG染色結果,其中p為血管翳,e為軟骨侵蝕,b為骨破壞,s為滑膜炎;B.對各組小鼠進行病理評分,其中a～d依次為骨質破壞、滑膜炎、血管翳、關節軟骨的病理學評分;C.第60天小鼠后足Micro-CT的代表圖(Mean±SD,t檢驗,*P<0.05)

A.BAZ對MH7A細胞存活的影響;B.SC144對MH7A細胞存活的影響;C.RAL和BAZ對MH7A細胞的平板克隆實驗結果

MH7A細胞接種于含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養基中,置于含5%CO2的37 ℃培養箱中培養。

1.2 藥物試劑與儀器免疫用牛Ⅱ型膠原(CII,#20022)、完全弗氏佐劑(CFA,#7001)和不完全弗氏佐劑(IFA,#7002)均購于美國Chondrex公司;BAZ購于江蘇正濟藥業股份有限公司;泊洛沙姆188(Poloxamer 188,P188)購于巴斯夫(中國)有限公司;SC144購于上海源葉生物科技有限公司;鹽酸雷洛昔芬(Raloxifene,RAL)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;基質膠(#356234)購于美國Corning公司;Transwell小室(8 μm孔徑,Corning,USA);酶標儀(M1000 Pro,Tecan,Switzerland);小動物活體Micro CT影像系統(Quantum GX,PerkinElmer,USA);倒置顯微鏡(CKX41,Olympus,Japan)。

1.3 實驗方法

1.3.1 CIA小鼠模型的建立小鼠隨機分為正常對照組、膠原誘導組。取2 mL濃度為2 mg·mL-1的CII醋酸溶液與等體積的濃度為4 mg·mL-1的CFA置于冰上充分混合,得到CII乳化液。在膠原誘導組的小鼠尾根部進行皮內緩慢注射所得的CII乳化液,注意避開血管,每只100 μL(含CII 100 μg)進行初次免疫,并設定為第0天。第21天,在小鼠尾根部1～2 cm處采用多點法再次注射100 μL/只同法新鮮配制的等體積CII醋酸溶液和IFA的混合乳化液進行增強免疫。自造模第21天開始,每3～4 d(每周2次)對免疫小鼠基于關節炎指數(arthritis index,AI)評分表(見表1)進行四肢關節評分,四肢關節腫脹計分相加為關節炎的總評分。評分最高分為16,評分≥4為模型成功。

表1 小鼠AI評分

1.3.2 動物分組給藥將膠原誘導組的小鼠隨機分為兩組,即模型對照組(Vehicle組)和Bazedoxifene治療組(BAZ組),并在初次免疫的第14天開始給藥至第57天,每周6次,周日停藥。動物實驗的實施方案如圖2A所示。給藥劑量與方法如下:①正常組:生理鹽水,0.1 mL·(kg·d)-1灌胃;②Vehicle組:60 mg·mL-1的P188水溶液,灌胃;③BAZ組:BAZ藥物5 mg·(kg·d)-1灌胃。其中,BAZ藥物的配制方法如下:取濃度為20 μg·μL-1溶解于DMSO的BAZ溶液50 μL,加入950 μL濃度為60 mg·mL-1的P188水溶液中,渦旋混勻,即得BAZ濃度為 1 mg·mL-1的藥物溶液。

1.3.3 動物關節腫脹觀察與病理學評價增強免疫后每3～4天,使用游標卡尺測量小鼠后肢足厚度,以此作為其關節腫脹的指標。采用蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin,H-E)觀察踝關節病理改變,番紅-固綠染色(safranine o and fast green,SO-FG)觀察軟骨破壞,并從滑膜細胞增生、細胞浸潤、關節軟骨及骨質破壞進行病理學評分[9]。采用micro-CT對小鼠踝關節進行掃描成像,觀察踝關節的損傷情況。

1.3.4 CCK-8法檢測BAZ對MH7A細胞存活率的影響取MH7A細胞并調整細胞密度為5×104mL-1,每孔100 μL接種于96孔板,貼壁生長過夜后,將原有培養基更換為含有不同藥物濃度的培養基,繼續培養24 h,之后每孔加入10 μL CCK-8試劑,置于37 ℃含5%CO2培養箱孵育4 h,使用酶標儀在450 nm處檢測光密度值,并計算細胞存活抑制率。實驗獨立重復3次。

1.3.5 平板克隆法檢測BAZ對MH7A細胞增殖的影響MH7A細胞接種于6孔板中,過夜使其貼壁并使細胞融合度達到80%,第2天每孔更換為2 mL含藥培養基,24 h后消化各孔細胞并用無藥的完全培養基收集和重懸,然后以每皿500個細胞的密度接種于6 cm的平板培養皿中,37 ℃、5%CO2培養約15 d,棄去培養基,PBS洗滌,用冷甲醇固定0.5 h,1%結晶紫染色1 h,用水清洗后掃描所得平板培養皿。實驗獨立重復3次。

1.3.6 細胞劃痕法檢測BAZ對MH7A細胞遷移的影響MH7A細胞以每孔5×105細胞密度接種于6孔板中,并加入2 mL/孔的含血清培養基,至細胞長滿后,更換無血清培養基使其饑餓過夜。采用無菌槍頭進行劃痕,用PBS清洗2遍后給予含不同濃度BAZ的無血清培養基,使用倒置顯微鏡記錄劃痕處細胞遷移的情況。實驗獨立重復3次。

1.3.7 Transwell實驗檢測BAZ對MH7A細胞侵襲的影響MH7A細胞接種于6孔板,當細胞融合度達60%時,加入含有不同BAZ濃度的完全培養基繼續培養24 h,之后棄去培養基并用PBS洗2遍,用胰酶消化細胞,并以無血清培養基重懸使其密度為6 000 μL-1,各組細胞取200 μL加入Transwell小室的上層(含基質膠),下層則加入600 μL的含20%胎牛血清的培養基。其中上層小室基質膠需預先配制,具體方法是:基質膠和無血清培養基按體積比1∶8在冰上進行稀釋,每孔40 μL加入小室的上層,37 ℃孵育4～6 h待基質膠凝固。細胞在Transwell中培養48 h后取出小室,固定,染色,在顯微鏡下拍照,評價細胞侵襲的能力。實驗獨立重復3次。

1.4 統計學分析采用SPSS 22.0軟件,所有數據以Mean±SD表示,采用t檢驗比較兩組之間的差異,P<0.05表示差異具有統計學意義。采用Graphpad Prism 7軟件繪圖。

2 結果

2.1 BAZ對CIA小鼠關節炎癥和腫脹的影響正常組小鼠無關節發紅和腫脹,Vehicle組即CIA模型組的小鼠在兩次免疫后出現關節腫脹、趾端發紅、足趾增厚等狀況,嚴重者出現關節活動受限,在病情后期部分小鼠踝關節出現強直樣改變。與Vehicle組相比,BAZ治療組AI評分顯著降低(見圖2B,P<0.05),后足厚度也較Vehicle組明顯下降,并在第32天出現顯著性差異(P<0.05,見圖2D)。各組小鼠后肢關節外觀如圖2C所示(第57天)。由于CIA模型的自限性,小鼠后肢腫脹厚度在實驗后期出現輕度消退(見圖2D)。

2.2 BAZ減輕CIA小鼠關節炎如圖3A所示,正常小鼠踝關節未見炎性細胞浸潤,滑膜增厚、骨和軟骨破壞。與模型對照組相比,BAZ治療組能緩解小鼠踝關節的滑膜炎(見圖3As)、血管翳(見圖3Ap)、軟骨侵蝕(見圖3Ae)和骨破壞(見圖3Ab),其各項評分均顯著性低于CIA模型組(見圖3B)。以上表明BAZ可減輕小鼠關節病理損傷。Micro-CT的結果顯示,與CIA模型組相比,BAZ治療組后肢關節間隙狹窄和骨破壞明顯改善(見圖3C)。上述結果表明,BAZ對CIA小鼠關節炎有治療作用。

2.3 BAZ對MH7A細胞存活和增殖的作用結果如圖4A所示,隨BAZ濃度的增加,MH7A的細胞存活率明顯降低。SC144是gp130的抑制劑[10],該藥對MH7A的細胞存活率具有濃度依賴性的抑制作用(見圖4B)。BAZ和SC144對MH7A細胞的IC50值分別是12.96、11.55 μmol·L-1,說明靶向gp130可以抑制滑膜細胞存活。圖3C的平板克隆實驗結果進一步證實BAZ濃度依賴性抑制MH7A細胞增殖,在BAZ 20 μmol·L-1組未見明顯的MH7A細胞增殖。RAL和BAZ均是ER調節劑,但RAL在抑制gp130方面較BAZ弱[7],RAL不能有效抑制MH7A的增殖(見圖4C)。

2.4 BAZ對MH7A細胞劃痕愈合的作用如圖5所示在MH7A細胞劃痕24 h后,與未接受藥物的細胞組相比,BAZ給藥組劃痕的愈合明顯受到抑制,其中15 μmol·L-1給藥組最為明顯,劃痕依然可見。未給藥組愈合修復接近100%融合,10 μmol·L-1組的劃痕處部分出現了遷移的細胞。所有各組在0時的劃痕一致(數據未列出)。以上說明了BAZ抑制細胞遷移的作用。

圖5 劃痕給藥24 h后MH7A細胞愈合圖(各組0時未列出)

2.5 BAZ對MH7A細胞侵襲的作用如圖6所示,BAZ給藥的10、20 μmol·L-1均能明顯減少細胞侵襲遷移到下室的數量。說明了BAZ對MH7A細胞侵襲和遷移的抑制作用。

圖6 MH7A細胞在接受BAZ作用24 h后接種于Transwell小室繼續培養48 h之后細胞侵襲檢測的各組代表

3 討論

CIA模型采用異源性CII免疫動物,誘導自身免疫性反應,從而產生類似類風濕關節炎的關節紅腫、滑膜增生、炎性細胞浸潤、血管翳形成、關節及周圍軟骨壞損。CIA模型是目前公認的RA最佳模型[11]。本研究以8周雄性CIA小鼠為研究對象,說明BAZ能有效降低AI評分,緩解小鼠后足腫脹,減輕RA病變,證實BAZ對RA的治療作用。在此基礎上,本研究以MH7A為模型細胞,發現BAZ具有抑制MH7A增殖、侵襲和遷移的作用,進而從BAZ干預FLS角度解釋了BAZ治療RA的具體機制。

BAZ最初是作為SERM聯合結合雌激素(conjugated estrogens)以組織選擇性雌激素復合物(tissue-selective estrogen complex,TSEC)的形式被美國FDA批準,用于絕經后女性骨質疏松癥的治療。在骨組織,BAZ能作為雌激素受體(estrogen receptor,ER)-β的激動劑,具有調節骨轉換(bone turnover)的作用[12]。最近臨床報道,BAZ能有效預防絕經后RA患者糖皮質激素誘導的骨質疏松[12]。在動物實驗水平,采用去卵巢(ovariectomized,OVX)的CIA(OVX-CIA)小鼠模型可模擬女性絕經后的RA癥狀。基于此,因為雌二醇(17β-estradiol,E2)的抗炎作用,學者們研究發現BAZ聯合E2組(TSEC)發揮對骨關節炎的治療作用與單用E2近似,但TSEC組更能有效降低骨髓中IL-6水平、抑制破骨前體細胞(preosteoclast)形成、減少血清中的抗膠原蛋白抗體(anti-CII IgG)[13]。以同為第三代SERM的拉索昔芬(lasofoxifene,LAS)做對照,發現BAZ和LAS都能降低OVX-CIA小鼠關節炎的AI評分,抑制滑膜炎,減少軟骨及骨的侵蝕[14]。BAZ和LAS在OVX-CIA模型中表現出抗關節炎和骨保護作用的雙重作用,強調了SERM在應用于絕經后女性RA治療的價值。

事實上,BAZ是多靶點藥物,BAZ既充當ER配體又是IL-6/gp130的抑制劑,干預IL-6信號通路發揮抗炎作用[15]。本研究發現,gp130抑制劑SC144和BAZ均能抑制滑膜細胞存活。有報道采用抗gp130單抗能抑制RA患者破骨細胞的分化和形成[16],說明了gp130作為RA治療靶點而充滿前景。無論小鼠是否OVX,BAZ都顯示了對CIA小鼠關節炎的治療作用,但BAZ對OVX-CIA小鼠關節炎癥的抑制能力弱于LAS和E2[13-14]。由于RA病理炎癥是由大量分子調控的,我們建議合理采用聯合用藥的策略,通過抑制多個靶點分子,更好的阻止或逆轉RA進展。