參芪顆粒質量標準研究

張紅巖，古偉玲，張桐語，秦鑫，楊振

（吉林省中醫藥科學院，吉林 長春 130012）

參芪顆粒是由黃芪、黨參、肉桂、大黃和益母草等中藥材經過水提、干燥等一系列處理后加入輔料而制備成的中藥顆粒劑，主要用于脾腎氣虛以及濕濁內蘊型慢性腎功能衰竭的治療，臨床應用中取得了較好的效果，現擬對其創新中藥復方制劑開發進行研究。為了對成品有更好的控制方法，保證參芪顆粒在用藥上的安全有效及質量可控，在前期完成了參芪顆粒制備工藝研究的基礎上，我們又對制成的樣品開展了一系列質量控制方法規范化研究，利用色譜技術手段對所得樣品中各藥材的組成成分開展了色譜鑒定研究。經過深入研究后，黃芪、益母草和大黃的TLC 斑點鑒別顯著，陰性無干擾，重復性好。此外，在試驗中還研究了利用高效液相色譜法測定參芪顆粒制劑中重要藥效成分黃芪甲苷含量的方法，對參芪顆粒3 批樣品內所含黃芪甲苷依據所確定方法進行測定，并確定了其含量限度。通過以上研究，為藥品質量的控制打下堅實的基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（LC-10ATvp 型日本島津）；蒸發光檢測儀（ELSD-6000美國奧泰）；工作站（LCsolution Lite日本）；電子天平（XS105 型梅特勒-托利多）；超聲儀（250 W，頻率為40 KHz 昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸水蘇堿對照品（中檢院，批號：110712-201916，96.9%，供含量測定）；黃芪甲苷對照品（中檢院，批號：110781-201717，96.9%，供含量測定）；大黃對照藥材（中檢院，批號：120902-201311）；參芪顆粒（吉林紫鑫藥業股份有限公司，3 批參芪顆粒樣品批號：20210701、20210702、20210703）；乙腈（液相流動相組成）為色譜純；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 黃芪薄層色譜鑒別 取參芪顆粒10 g，置于研缽中，研磨成粉末，加入含4%濃氨試液的80%甲醇溶液60 mL，30 min超聲處理，過濾得濾液，將濾液蒸干，加入20 mL 水使殘渣溶解，以水飽和正丁醇為提取溶劑，20 mL/次，提取2 次，提取完成后合并正丁醇液，再使用30 mL 正丁醇飽和水洗1 次，蒸干正丁醇液，用1 mL 80%甲醇溶解殘渣，即得供試品溶液。另使用80%甲醇為溶劑配制成1 mg/mL 的黃芪甲苷對照品溶液。取不含黃芪的陰性樣品10 g，按供試品制備方法制得陰性對照溶液。按薄層色譜法（中國藥典2020年版四部 通則0502）試驗，吸取供試品溶液、陰性對照溶液各5μL、對照品溶液2μL，分別點于同一硅膠G薄層板點樣，展開劑為三氯甲烷－甲醇－水（13:7:2），展開完成后，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇試液顯色，在105 ℃烘烤至斑點顯色清晰。供試品色譜中，與黃芪甲苷對照品色譜對應的位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，薄層結果，見圖1。

圖1 黃芪TLC 鑒別Fig.1 TLC chromatogram of

2.1.2 大黃薄層色譜鑒別 取參芪顆粒10 g，置于研缽中，研磨成粉末，加入80 mL 甲醇，進行30 min 超聲處理，過濾得濾液，將濾液蒸干，加水20 mL 使殘渣溶解，加鹽酸2 mL 后回流30 min，隨即立即冷卻，以三氯甲烷為提取溶劑進行提取，20 mL/次，提取2 次，提取完成后合并三氯甲烷液，蒸干，使用1 mL 三氯甲烷溶解殘渣，即得供試品溶液。另取2 g 大黃對照藥材，按上述方法制得對照藥材溶液。再取不含大黃的陰性樣品10 g，同法制得陰性對照溶液。按薄層色譜法（中國藥典2020 年版四部通則0502）試驗，吸取上述3 種溶液各5μL，于同一個硅膠G 薄層板上點樣，展開劑為石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15:5:1）的上層溶液，展開完成后，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，與對照藥材色譜相應位置上，顯相同顏色4個熒光斑點，陰性對照無干擾，薄層結果，見圖2。

圖2 大黃TLC 鑒別Fig.2 TLC chromatogram of

2.1.3 益母草薄層色譜鑒別 取參芪顆粒10 g，置于研缽中，研磨成粉末，加70%乙醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至5 mL，放冷，通過樣品柱（采用中性氧化鋁3 g裝柱），以50 mL 70%乙醇溶液進行洗脫，并將洗脫液蒸干，以1 mL 無水乙醇為溶劑溶解殘渣，即得供試品溶液。另取鹽酸水蘇堿對照品，以無水乙醇為溶劑制成1 mg/mL的對照品溶液。再取不含益母草的陰性樣品10 g，同法制得陰性對照溶液。按薄層色譜法（中國藥典2020 年版四部 通則0502）試驗，分別吸取10μL 供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液，分別點于同一個硅膠G 薄層板上，以丙酮無水乙醇－鹽酸（10:6:1）為展開劑展開，取出，晾干，在105 ℃加熱15min，放冷，噴以稀碘化鉍鉀試液和三氯化鐵試液（10:1）混合溶液至斑點清晰顯色。從薄層板斑點顯色結果可看出，供試品與對照品色譜在相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，薄層結果見圖3。

圖3 益母草TLC 鑒別Fig.3 TLC chromatogram of

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：YWC-C18（4.6 mm 150 mm，5μm）；流動相：乙腈：水（50:50）；柱溫：30 ℃；蒸發光散射檢測器檢測；液相漂移管溫度：100 ℃，空氣泵空氣流速：2.8L/min。理論板數按黃芪甲苷峰計算，不得低于4000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品（中檢院，批號：110781-201717）適量，以80%甲醇為溶劑進行溶解，制成每l mL 含0.25 mg 的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取參芪顆粒，置于研缽中，研磨成粉末，取1 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加含4%濃氨試液的80%甲醇溶液20 mL，隨后進行超聲處理（250 w，40 kHz），40 min 后取出，放冷，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液15 mL，蒸干，殘渣加水20 mL 使溶解，用水飽和正丁醇提取，10 mL/次，提取5 次，將正丁醇液合并后蒸干，殘渣用80%甲醇溶解并轉移至5 mL 量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 專屬性試驗 取參芪顆粒中除去黃芪外其余藥材，按工藝制成陰性樣品，以上述擬定的方法制成供試液及陰性對照液，按上述色譜條件測定，陰性無雜峰干擾，達到很好分離，見圖4。

圖4 參芪顆粒高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of Shenqi granules

2.2.4.2 線性范圍考察 取黃芪甲苷對照品，加80%甲醇制成0.4981mg/mL的溶液，分別吸取0.5mL、1mL、3 mL、5 mL、7 mL 和9 mL，分別放入10 mL 瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取上述對照品溶液各20μL，按2.2.1 條件進行測定。以黃芪甲苷μg數的Log 值為橫坐標，色譜峰峰面積積分值的Log 值為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，在0.498 1～8.965 2μg范圍內，黃芪甲苷量的Log 值與峰面積積分值的Log值為良好線性關系。回歸方程為y=1.77x+5.54，相關系數r=0.998 2。

2.2.4.3 精密度考察 精密吸取2.2.3 項下供試品溶液20μL，且連續進樣6 次，測定峰面積積分值為373 004、386 464、378 282、373 465、363 715 和376 759，RSD 為1.42%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.4 穩定性試驗 精密吸取2.2.3 項下中同一份供試品溶液20μL，在不同時間點進樣，進樣時間0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h。對應不同時間點測得得峰面積積分值分別為361 107、359 436、352 151、350201、359611、363 622 和369 266。結果表明，黃芪甲苷峰面積積分值的RSD 為1.82%，證明48h 內供試品溶液基本穩定。

2.2.4.5 重復性試驗 對同一批次參芪顆粒樣品按2.2.3 項下方法制備供試品溶液，共6 份，按照方法測定，6次測定結果分別0.6016mg/g、0.6105mg/g、0.6024mg/g、0.597 5mg/g、0.5892mg/g 和0.5996mg/g，RSD=1.15%，測定結果表明，本方法重復性良好。

2.2.4.6 加樣回收率試驗 取已知含量參芪顆粒樣品6 份（黃芪甲苷含量為0.602 mg/g），分別精密加入一定量的黃芪甲苷對照品，按照2.2.3 項下方法制備，進樣測定并分析，計算回收率，黃芪甲苷平均回收率為98.35%，RSD=1.16%，見表1。

表1 加樣回收率測定結果Table 1 Recovery determination results

2.2.4.7 樣品測定 對中試規模制備的3 批參芪顆粒樣品中黃芪甲苷含量進行了測定，見表2。

表2 參芪顆粒中黃芪甲苷含量測定結果Table 2 Content determination results of astragaloside IV in Shenqi granules

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別

3.1.1 黃芪鑒別 黃芪為臨床治療的一味常見中藥材，味甘，性微溫，歸肺、脾經，其主要功效為補氣升陽、利水消腫、固表止汗、托毒排膿和生津養血等，在臨床上多用于氣虛乏力、納差便溏及中氣下陷等的治療。根據研究表明，黃芪化學成分種類多樣，多糖類、黃酮類和皂苷類等是主要化學成分，其中，黃芪甲苷是主要的皂苷類化學成分，在抗衰老、免疫調節、降糖調脂、抗菌和抗輻射等方面發揮重要作用[1,2]。

《中國藥典》2020 版一部黃芪鑒別項下中采用樣品經4%濃氨試液的80%甲醇提取后進行鑒別，但本品為中藥復方制劑，雜質多，若直接采用藥典方法制備供試品溶液直接點樣進行鑒別，干擾較大，故參考相關研究方法[3-6]，采用將樣品的80%甲醇提取液蒸干后，經水溶解后用正丁醇提取，用水洗滌方法，可除去大部分色素等雜質，所制備的供試品溶液不黏稠，易于點樣。采用藥典薄層色譜條件進行鑒別[7]，供試品色譜中特征斑點清晰，雜質斑點少，方法重復性好，可作為制劑中黃芪鑒別方法。

3.1.2 大黃鑒別 大黃其性寒，味苦，歸脾胃、大腸、肝心包經，臨床上主要用于實熱積滯便秘、血熱吐衄、目赤腫痛、癰腫疔瘡、腸癰腹痛、瘀血經閉、產后瘀阻和跌打損傷等，可瀉火攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經及利濕退黃。大黃化學成分主要集中在蒽醌類、蒽醌衍生物類和蒽酮類等，同時也包括有機酸、糖類等，其中，蒽醌類、蒽酮類是大黃的有效成分[8,9]。據報道，大黃可在一定程度上治療腎纖維化，其原理為骨形態發生蛋白-7（BMP-7）的表達因大黃素的存在而被促進，腎間質纖維化被延緩[10]。在薄層鑒別試驗中，參考藥典及文獻方法[11]，對比石油醚（30～60 ℃）甲酸乙酯－甲酸（15:5:1）及正己烷－乙酸乙酯－冰醋酸（15:5:0.3）兩種展開系統鑒別效果，結果以藥典方法中展開系統鑒別效果最佳。

3.1.3 益母草鑒別 益母草成分較復雜，主要為生物堿、黃酮類化學成分[12]。鑒別試驗中，參考《中國藥典》2020 版一部益母草鑒別項下供試品制備方法，增加氧化鋁純化步驟，可更好除去干擾物質，從而使鑒別特征斑點清晰，具有更好的重復性。

3.2 含量測定

3.2.1 系統適用性試驗 色譜條件選擇中主要包括色譜柱和流動相選擇，并主要參考文獻測定方法[13-18]，在試驗中，對比了下列色譜條件的分離情況：色譜柱主要包括YWC-C18（4.6 mm 250 mm，5μm）、Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm 250 mm，5μm）和Ultimate-C18（4.6 mm 250 mm，5μm）；流動相主要包括：乙腈：水（49:51）、乙腈：水（50:50）和乙腈：水（51:49）。試驗結果表明，通過上述3 種色譜柱分別與3 種不同比例乙腈:水流動相組成不同的色譜條件，以分離度、色譜峰形狀、保留時間等相關因素進行考察，最終以YWCC18（4.6 mm 250 mm，5μm）色譜柱與乙腈:水（50:50）組合，分離效果最好，故選擇為色譜條件。

3.2.2 參芪顆粒樣品溶液制備方法選擇 3 種溶劑被用于提取考察，結果表明，以乙醇、甲醇和80%甲醇為溶劑，超聲40 min獲得的參芪顆粒樣品中黃芪甲苷含量分別為0.493 6 mg/g、0.577 4 mg/g 和0.603 2 mg/g，樣品中黃芪甲苷含量最高的是80%甲醇；進一步對超聲提取30 min 和超聲提取50 min 獲得供試品中黃芪甲苷含量進行了考察，結果分別為0.552 2 mg/g 和0.603 6 mg/g，表明提取40min，黃芪甲苷可被完全提取。

3.2.3 耐用性試驗 取同一批號樣品，參照上述測定條件，考察在測定條件有小的變動時對測定結果的影響程度。試驗主要考察了不同品牌色譜柱、不同柱溫和不同流動相配比等變動因素對測定結果的影響。

本試驗選用YWC-C18、AgilentZORBAXSB-C18、Shimpack-C183 個不同品牌的色譜柱測得樣品中黃芪甲苷含量分別為：0.6001mg/g、0.6101 mg/g 和0.5984 mg/g；采用YWC-C18 色譜柱，分別在25 ℃、30 ℃、35 ℃條件下測得樣品中黃芪甲苷含量分別為：0.606 9 mg/g、0.600 1 mg/g 和0.596 3 mg/g；選擇乙腈—水（50:50）、乙腈—水（49:51）、乙腈—水（51:49）3 個比例流動相測得黃芪甲苷含量分別為0.597 5 mg/g、0.593 7 mg/g 和0.582 7 mg/g。上述試驗結果表明，在色譜條件有微小變化時，樣品中黃芪甲苷含量無明顯變化，本方法耐用性良好。本研究通過薄層鑒別和高效液相方法建立參芪顆粒質量標準，以期為后續開發新藥奠定基礎。