HPLC 法測(cè)定柴胡舒肝丸（大蜜丸）中香附烯酮和ɑ-香附酮的含量

崔業(yè)波，宋瑩，馬曉靜，張大勇，趙艷，馬彧※

（1.四平市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 四平 136000；2.吉林省藥品檢驗(yàn)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130033）

柴胡舒肝丸是由茯苓、豆蔻、酒白芍、麩炒枳殼和醋香附等25 味藥組成的大蜜丸或小蜜丸，臨床主要功效疏肝理氣，消脹止痛。其用于肝氣不舒，胸肋痞悶，食滯不清，嘔吐酸水。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)最早收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二冊(cè)》，自從1995 年版《中國(guó)藥典》至今，一直收載于《中國(guó)藥典》一部中[1]，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)過(guò)多次的提高，質(zhì)控指標(biāo)設(shè)置相對(duì)完整，鑒別項(xiàng)包括酒大黃、茯苓、甘草、黃芩和炒檳榔顯微鑒別，木香、酒大黃和防風(fēng)的薄層色譜鑒別，檢查項(xiàng)包括水分及丸劑通則項(xiàng)下規(guī)定，含量測(cè)定為本品含黃芩以黃芩苷（C21H18O11）計(jì)，小蜜丸每1 g 不得少于0.90 mg，大蜜丸每丸不得少于9.0 mg；含厚樸以厚樸酚（C18H18O2）與和厚樸酚（C18H18O2）的總量計(jì)，小蜜丸每1 g 不得少于0.20mg，大蜜丸每丸不得少于2.0 mg，相對(duì)于25 味中藥，質(zhì)控指標(biāo)仍然有提升空間。其中醋香附的質(zhì)控指標(biāo)并未設(shè)置。因此，有必要建立醋香附的質(zhì)控方法，有助于完善柴胡舒肝丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

柴胡舒肝丸中醋香附具有疏肝解郁，理氣寬中，調(diào)經(jīng)止痛。其可用于肝氣郁滯，胸肋脹痛等功效，歸肝、脾和三焦經(jīng)。中醫(yī)認(rèn)為肝藏血、脾統(tǒng)血，只有氣血調(diào)和，才可起到疏肝寬中的功效，因此，醋香附為柴胡舒肝丸主要功效藥味，是其臨床療效的基礎(chǔ)保障。目前研究報(bào)道多集中在臨床研究、合理用藥及指紋圖譜等方面的研究[2-8]。而針對(duì)柴胡舒肝丸中醋香附的報(bào)道較少。該品種規(guī)格包括大蜜丸和小蜜丸，本研究選擇大蜜丸為研究對(duì)象，以醋香附中香附烯酮和α-香附酮為目標(biāo)，建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定2 種成分含量，為柴胡舒肝丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供一種有效的方法。

1 材料與方法

美國(guó)Aglient 1260 高效液相色譜儀，賽多利斯BP211D 型電子天平。香附烯酮對(duì)照品（批號(hào):ST77690181）來(lái)自上海標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司，α-香附酮對(duì)照品（批號(hào)：110748-202117）來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，Merch 公司），乙酸乙酯（分析純，天津科密歐）；水由Milli-Q 系統(tǒng)制得。柴胡舒肝丸4 批，來(lái)自4 家企業(yè)，均為大蜜丸，批號(hào)依次為211202、20211003、210903、20211011。

2 結(jié)果與分件

2.1 色譜條件

色譜柱ZORBAXSB-C18（4.6mm 250mm,5μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取香附烯酮10.56mg和α-香附酮20.09mg，分別置20 mL 和50 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密量取4 mL 和2 mL，置10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻即可。

2.3 供試品溶液的制備

取供試品，大蜜丸2 丸，置圓底燒瓶中，連接揮發(fā)油測(cè)定管，加入200 mL 水，在揮發(fā)油測(cè)定管中加入約1 mL乙酸乙酯，連接冷凝管，加熱至沸騰，保持沸騰狀態(tài)1.5 h。分取乙酸乙酯層，并用適量甲醇自冷凝管端洗滌3 次，合并轉(zhuǎn)移置10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻即可。

2.4 缺醋香附藥味陰性對(duì)照溶液的制備

按照處方量稱(chēng)取缺醋香附藥味的其他24 味藥，以總量100 g 為基礎(chǔ)，加入煉蜜180 g，混勻，取大約2丸的量，按照2.3 項(xiàng)下同法制備陰性對(duì)照溶液。

2.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各5μL，注入液相色譜儀中，按照上述色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖（圖1）。陰性對(duì)照溶液在目標(biāo)成分保留時(shí)間位置處無(wú)干擾，且與相鄰色譜峰達(dá)到基線分離，專(zhuān)屬性良好。

圖1 柴胡舒肝丸HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC of Chaihushugan pills

2.6 線性關(guān)系考察

取對(duì)照品溶液，依次精密量取1μL、2μL、5μL、8μL 和10μL 注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，以目標(biāo)成分質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，分別得香附烯酮和α-香附酮的線性方程分別為Y=3 133.833X+9.804，R2=1.000，范圍0.211～2.112μg，和Y=3919.142X+0.649，R2=1.000，范圍0.080～0.804μg，表明線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液5μL注入液相色譜儀中，注入液相色譜儀中，按照上述色譜條件同法分析6 次，記錄色譜圖。以香附烯酮和α-香附酮峰面積計(jì)算精密度，RSD 分別為0.5%和0.7%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批（批號(hào)：211202）樣品2 丸，按2.3 項(xiàng)下方法操作，制成供試品溶液，同樣方法處理6 份，按照上述色譜條件測(cè)定，樣品中含香附烯酮0.10 mg/丸，RSD為1.7%；α-香附酮0.28 mg/丸，RSD 為1.4%，表明該法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取重復(fù)性試驗(yàn)一供試品溶液，分別于0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h 和24 h，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)得香附烯酮和α-香附酮峰面積的RSD分別為1.0%和0.8%，表明供試品溶液至少在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批（批號(hào)：211202）樣品1 丸，等比例加入目標(biāo)成分（取香附烯酮20.66 mg 和α-香附酮26.60 mg，分別置50 mL 和20 mL 量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，分別精密量取0.3mL和0.2mL）置500 mL圓底燒瓶中，按照2.3 項(xiàng)下同法處理6 份，按照上述色譜條件分析，分別計(jì)算回收率（表1），表明準(zhǔn)確度滿足要求。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recovery results

2.11 樣品的測(cè)定

取上述4 批樣品各2 丸，按照2.3 項(xiàng)同法處理，平行處理3 份，按照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算柴胡舒肝丸中香附烯酮和α-香附酮的含量，見(jiàn)表2。

表2 柴胡舒肝丸中香附烯酮和α-香附酮的含量Table 2 Cyperotundone and ɑ-cyperone of content determination in Chaihushugan pills

3 討論

柴胡疏肝丸（大蜜丸）服用量為1 次1 丸，一日2次。本文以日服用量為基礎(chǔ)，選擇柴胡舒肝丸日服量作為分析用量。利用醋香附中香附烯酮和α-香附酮具有揮發(fā)的特性，采用水蒸氣蒸餾的方式制備供試品溶液。并分別考察乙酸乙酯、二甲苯、石油醚（60～90℃）和甲苯對(duì)揮發(fā)油的接收能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二甲苯和甲苯在供試品溶液制備過(guò)程中，雖然有效的接受揮發(fā)油，但是存在溶劑間兼容性問(wèn)題；石油醚揮發(fā)性較強(qiáng)，在蒸餾過(guò)程中減少明顯，最后選擇乙酸乙酯作為揮發(fā)油接受液。

目前報(bào)道的供試溶液的制備采用溶劑浸泡提取方式居多[7-10]，而柴胡舒肝丸中共計(jì)25 味藥，均以原粉入藥，成分極其復(fù)雜，采用溶劑浸泡提取，檢測(cè)方法不僅難以開(kāi)發(fā)，而且方法專(zhuān)屬性也不好。本文采用水蒸氣蒸餾的方法，對(duì)目標(biāo)成分進(jìn)行了凈化，提高了分析的專(zhuān)屬性和準(zhǔn)確度。

現(xiàn)階段對(duì)香附成分的分析方法較多，香附烯酮和α-香附酮的分析多采用氣相色譜法[11-15]，而本文選擇液相色譜－二極管陣列檢測(cè)器分析，通過(guò)計(jì)算峰純度和光譜圖，調(diào)整色譜條件，已達(dá)到滿意的分析結(jié)果和色譜峰。與氣相色譜法比較，液相色譜+二極管陣列檢測(cè)器方法優(yōu)勢(shì)明顯。采用DAD 檢測(cè)器對(duì)二者進(jìn)行光譜掃描，香附烯酮最大吸收波長(zhǎng)為250 nm，α-香附酮最大吸收波長(zhǎng)為254 nm，結(jié)合樣品中的含量高低，優(yōu)選254 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。并考察了Agilent 5TCC18(2)、ZORBAX ECLIPSE XDB-C18 和Dimaonsil C18 三款同規(guī)格（250 mm 4.6 mm,5μm）色譜柱，均可將二者完全分離，且與相鄰色譜峰分離度大于1.5。

含量測(cè)定結(jié)果表明，不同企業(yè)間柴胡疏肝丸中香附烯酮和α-香附酮含量差異較大，本研究的取樣方式為整丸取樣，在一定程度上反映了樣品的均一性，在目前的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未作質(zhì)控，本文也為類(lèi)似中成藥的分析方法提供新的思路。現(xiàn)階段對(duì)香附研究報(bào)道認(rèn)為藥理活性與其揮發(fā)油成分相關(guān)[16-19]。本文建立了HPLC法對(duì)柴胡疏肝丸中香附（制）的香附烯酮和α-香附酮含量測(cè)定，其結(jié)果建議以二者總量表示更為合理準(zhǔn)確。