枇杷葉提取物干預博萊霉素誘導肺纖維化大鼠MH-S細胞炎癥反應及機制研究

王俊男，楊亞萍※，張靖

（1.張家口市第一醫院呼吸內科，河北 張家口 075000；2.張家口市第一醫院神經內科，河北 張家口 075000）

肺纖維化是多種彌漫性間質肺疾病的主要結局，具有進行性、間質纖維化等特點，其中特發性肺纖維化（PF）最為常見。研究發現，PF預后效果差，發病率和死亡率逐年上升[1,2]。臨床主要表現為肺纖維化嚴重，肺泡巨噬細胞炎癥因子堆積、成纖維細胞募集和大量細胞外基質（ECM）沉積等[3-7]。研究表明，枇杷葉提取物為薔薇科植物枇杷[Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl.]的干燥葉，采用水蒸氣蒸餾法提取后的活性成分，主要含有三萜酸、揮發油、倍半萜、黃酮和糖苷類等成分，而三萜酸類成分為其主要的活性成分，具有拮抗肺纖維化損傷的作用，但其機制尚不清楚[8]。本研究從枇杷葉提取物與肺泡巨噬細胞炎性因子臨床相關性著手，旨在探究枇杷葉提取物在肺纖維化過程中肺泡巨噬細胞相關炎癥因子NF-κB、IL-17、TNF-α和MAPK/NF-κB信號通路相關蛋白p-p38 p-ERK1/2 等的表達情況，以期為肺纖維化提供新的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

Wistar 大鼠，雄性，SPF 級，7 周齡，180～240 g，購自深圳海思安生物技術有限公司，許可證號為SCXK（深）2019-0006，全部試驗大鼠置于無菌動物飼養室（溫度：20～24 ℃，濕度：65%～75%），光照12h/黑暗12h內適應性飼養1 周。

1.2 試驗材料

博萊霉素（CAS：11006-33-0，貨號：YT2280，規格：8×1.25 mL），購自哈爾濱博萊制藥有限公司；甲潑尼松龍片（批準文號：H31020771），購自上海上藥信誼藥廠；NF-κB、IL-17 和TNF-α ELISA 試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自上海富雨生物試劑有限公司；枇杷葉固形物（來自中國科學院植物研究所，CAS：0725-008，主要成分為三萜酸類，HPLC 檢測含量約1.32%）；甲潑尼龍琥珀酸鈉注射液（批準文號：H20080284），購自輝瑞制藥有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藥物制備 用天平稱取枇杷葉固形物50 g，粉碎，過40 目篩，置于燒杯中，加入100mL蒸餾水，4 ℃，浸泡3 h，用水蒸氣蒸餾法提取制備標準濃縮液，以0.9%氯化鈉溶液混勻后制備1.27、2.54、3.81 mL/kg的混懸液，備用。

1.3.2 肺纖維化Wistar 大鼠模型制備及樣本采集將120 只雄性Wistar 大鼠隨機分為生理鹽水（NS）組、模型（BLM）組、陽性對照組（0.45 mg/kg）、EBJE高（3.81 mL/kg）、中（2.54 mL/kg）、低（1.27 mL/kg）劑量組，每組20 只。各組氣管內一次性灌注博來霉素（5 mg/kg），生理鹽水（NS）組給予同等體積的生理鹽水灌注，制備肺纖維化模型。造模成功后第1 天開始灌胃給藥，1 次/d，共28 d。依據《藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算》[9]，NS組、模型組給予1 mL 生理鹽水溶液，高、中、低劑量組分別給予1 mL枇杷葉混懸液，濃度分別為3.81 mL/kg、2.54 mL/kg、1.27 mL/kg，陽性對照組給予1 mL，0.45 mg/kg甲潑尼龍琥珀酸鈉注射液。造模后第29 天腹腔注射20%烏拉坦麻醉處死，取雙側肺組織，左肺去除筋膜、肌肉和結締組織，3 000 r/min，離心20 min，吸取上清液，經流式細胞儀分離MH-S 細胞，右肺多聚甲醛固定，進行病理染色。

1.3.3 Masson染色 右肺4%多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋切片，厚度4μm，完全脫蠟脫水后2 h 內進行Masson 染色，分別給予2.5% 濃度的重鉻酸鉀、1.37% 濃度鐵蘇木素、3.0% 麗春紅酸性品紅染色，經醋酸－磷鉬酸處理后行苯胺藍染色，分化，中性樹膠封片。顯微鏡觀察肺炎癥浸潤和肺纖維化程度。

1.3.4 RT-PCR 測定大鼠MH-S 細胞NF-κB、IL-17 和TNF-α mRNA 表達量 以GAPDH 為內參，NCBI 選取Wistar 大鼠中基因序列，cDNA 文庫法設計NF-κB、I L-17、TNF-α的PCR 引物，NF-κB、IL-17、TNF-αq PCR試劑盒，擴增參數：首次溫度95 ℃，4 min；二次淬火93 ℃，8s；擴增參數：55 ℃，45 s，30 個循環。2-??Ct法衡量NF-κB、IL-17 和TNF-α mRNA 的相對表達量。

1.3.5 ELISA 檢測大鼠MH-S 細胞NF-κB、IL-17 和TNF-α蛋白表達量 收集MH-S細胞上清液，3000r/min，離心20 min；取上清液于1.5 mL EP管內保存。NF-κB、IL-17 和TNF-α蛋白表達量、依據ELISA 試劑盒說明書嚴格操作，A450 nm測定OD 值，計算大鼠NF-κB、IL-17 和TNF-α/MAPK 水平，重復3 次。依據ELISA集成試劑盒標注的標準蛋白濃度曲線計算濃度。

1.3.6 Western Blot檢測大鼠MH-S細胞p-p38 MAPK，p-38 MAPK，p-ERK1/2，ERK1/2 蛋白表達量 收集MH-S 細胞上清液，依據試劑盒說明書提取蛋白質，12 000 r/min，20 min 離心，制備蛋白樣品，備用。制備10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠作為分離膠，制備4% SDS-聚丙烯酰胺凝膠作為濃縮膠，進行Western Blot 試驗，檢測MH-S細胞p-p38 MAPK，p-38 MAPK，p-ERK1/2，ERK1/2 蛋白表達量。

1.4 統計學分析

2 試驗結果

2.1 各組大鼠肺纖維化病理變化情況

顯微鏡觀察顯示，NS 組肺組織基本正常，模型組肺組織出現明顯的紋理增粗，肺空洞比例增加，肺組織炎癥因子浸潤等現象，肺纖維化進程明顯，提示造模成功；與模型組相比，枇杷葉提取物高、中、低劑量組肺組織紋理增粗現象明顯得到改善，肺空洞比例明顯降低，高劑量組變化最為明顯，提示不同濃度枇杷葉提取物可以起到干預肺組織炎癥因子浸潤和肺纖維化進程的作用（如圖1）。

圖1 各組肺纖維組織Masson 病理染色（100 ）Fig.1 Masson pathological staining of lung fibrous tissue in each group(100)

2.2 各組大鼠MH-S細胞NF-κB、IL-17和TNF-α炎性因子mRNA表達情況

與NS 組相比，模型組NF-κB、IL-17 和TNF-α的mRNA 水平明顯升高（P ＜0.05）；模型組相比，陽性對照組，枇杷葉提取物各劑量組NF-κB、IL-17 和TNF-α的mRNA 水平顯著下降（P ＜0.05）且NF-κB、IL-17和TNF-α mRNA 相對表達量與干預濃度呈負相關（r=-0.754、-0.826、-0.810，Z=19.254、29.551、24.777），見表1。

表1 各組NF-κB、IL-17 和TNF-α炎性因子mRNA 相對表達水平Table 1 Relative mRNA expression levels of NF-κB,IL-17 and TNF-α inflammatory factors in each group

2.3 各組大鼠MH-S細胞NF-κB、IL-17和TNF-α炎性因子蛋白表達情況

與NS 組相比，模型組肺組織大鼠MH-S 細胞NF-κB、IL-17 和TNF-α的濃度明顯升高（P ＜0.05）；與模型組相比，陽性對照組，枇杷葉提取物各劑量組NF-κB、IL-17 和TNF-α的蛋白表達水平明顯下降（P＜0.05）且肺組織MH-S 細胞NF-κB、IL-17 和TNF-α蛋白表達水平與干預濃度呈負相關（r=0.725、0.773、0.789，Z=17.256、11.254、25.364），見圖2。

圖2 各組NF-κB、IL-17 和TNF-α炎性因子蛋白表達水平Fig.2 Expression levels of NF-κB,IL-17 and TNF-α inflammatory factor proteins in each group

2.4 EBJE對各組MAPK表達水平的影響

與對照組相比，模型組中肺組織肺泡巨噬細胞MAPK 濃度明顯降低（P ＜0.05）；與模型組相比，枇杷葉干預組、甲潑尼龍琥珀酸組MAPK 的表達水平明顯上升（P ＜0.05）；枇杷葉各劑量組比較中，肺組織肺泡巨噬細胞MAPK 與干預濃度呈正相關（r=0.826,Z=35.007），見表2。

表2 EBJE 干預后各組MAPK 表達水平Table 2 MAPK expression levels in each group after EBJE intervention

2.5 肺巨噬細胞MAPK蛋白表達水平與劑量相關性

劑量相關性比較中，肺巨噬細胞MAPK 蛋白表達水平與枇杷葉提取物濃度呈正相關，且總體相關度為0.895（Z=11.254），見表3。

表3 肺巨噬細胞MAPK 蛋白表達水平與劑量相關性Table 3 Dose dependence of MAPK protein expression levels in lung macrophages

2.6 各組大鼠MH-S細胞p-p38 MAPK，p-38 MAPK，p-ERK1/2，ERK1/2蛋白表達情況

與NS 組比較，模型組MH-S 細胞p38 MAPK 的磷酸化水平和ERK1/2 的磷酸化水平明顯升高（P ＜0.05），與模型組相比，陽性對照組，枇杷葉提取物各劑量組p38 MAPK 的磷酸化水平和ERK1/2 的磷酸化水平明顯降低（P ＜0.05）且與干預濃度呈負相關。

3 討論

肺纖維化在臨床上一般具有誘因多樣、病情進展復雜，抗纖維化藥物應用療效欠佳等臨床特點[10]，吡非尼酮（Pirfenidone,PFD）和尼達尼布（Nintedanib,BIBF 1120）的出現和臨床應用，雖然在一定程度上增加了肺纖維化患者的治療選擇性，并且有一定臨床效果[11]，但是具有費用昂貴、患者依從性差、預后效果不明顯和臨床副作用大等缺點，限制了患者的使用，中醫藥治療相對于西醫治療，具有作用機制途徑多、靶點富集、副作用較少等明顯的優點，多種代表性的中醫藥產物，如黃芪甲苷在治療肺纖維化方面取得了很大的進展[12,13]。因此，針對肺纖維化的中醫藥研究成為新的治療靶點。

研究表明，NF-κB、IL-17 和TNF-α是衡量肺纖維化常用的標志之一，能有效反應肺纖維化進展[14]，NFB是細胞內重要的核轉錄因子，參與了多種細胞因子及炎癥介質的轉錄調控，阻斷NF-κB 激活及炎癥因子介導的炎癥反應是肺纖維化防治的重要手段。絲裂酶原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPKs）級聯反應信號通路與炎癥氧化應激密切相關，抑制MAPK 信號通路能明顯減輕肺纖維化。研究報道，枇杷葉提取物具有抗炎、抗氧化等作用，但關于枇杷葉提取物拮抗肺纖維化中MAPK 通路的機制尚未闡明[15]。本文通過將枇杷葉提取物應用到大鼠肺纖維化模型中，對NF-κB、IL-17 和TNF-α等炎癥因子轉錄水平和蛋白水平進行檢測，發現枇杷葉提取物對肺纖維化炎癥損傷具有很好的治療作用，且高劑量具有更好地效果，同時，通過對MAKP/NF-κB 信號通路相關蛋白磷酸化程度進行檢測，發現枇杷葉提取物可以通過干預MAKP/NF-κB 信號通路達到減緩肺纖維化程度和炎癥浸潤程度的作用。本研究為枇杷葉的新型中藥制劑及保健食品的開發提供了研究基礎，有利于后期進一步的開發研究。