犬細(xì)小病毒吉林流行株的分離鑒定及VP2 基因的遺傳進(jìn)化分析

李紫仟，趙新宇，李向南，馮楚楚，李子樹，蔡佳希，薛向紅※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130112；3.吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司，吉林 長春 130112）

犬細(xì)小病毒病，又稱犬傳染性出血性腸炎，是由犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus,CPV）引起的急性傳染病，動(dòng)物感染后臨床表現(xiàn)為出血性腸炎、心肌炎、白細(xì)胞減少及脫水等[1]，尤其幼犬消化道的感染最為嚴(yán)重[2]，在20 世紀(jì)70 年代，美國首次發(fā)現(xiàn)細(xì)小病毒，隨后其他國家內(nèi)也陸續(xù)報(bào)道，該病毒傳染性強(qiáng)，病死率高，對犬只的健康造成嚴(yán)重影響，給我國寵物飼養(yǎng)行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

CPV屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，病毒粒子呈12面體結(jié)構(gòu)，且無囊膜，其直徑約為25 nm[4]。CPV 基因組全長為5 233 bp，其中含蓋了兩個(gè)開放閱讀框（ORF），分別由VP1、VP2 為主要成分的結(jié)構(gòu)蛋白（又稱衣殼蛋白）以及NS1、NS2 為主要成分的非結(jié)構(gòu)蛋白組成。VP2蛋白是病毒衣殼的主要組成部分，占病毒衣殼的90%，具有良好的免疫原性，在病毒復(fù)制和感染過程中有著至關(guān)重要的作用；VP2 蛋白氨基酸位點(diǎn)的改變對病毒感染宿主的范圍也有著重要的影響[5-7]。雖然CPV 是DNA 病毒，但其進(jìn)化十分迅速，目前根據(jù)CPV VP2 基因的進(jìn)化分為CPV-2a、CPV-2b、NewCPV-2a、NewCPV-2b、CPV-2c 等基因型，與原始CPV-2 型相比，新的基因型對宿主更具感染性，因此，新基因型已慢慢取代原有CPV-2型，在世界范圍內(nèi)大規(guī)模傳播[8-10]。2010 年CPV-2c 在中國吉林省犬細(xì)小病毒2c型首次發(fā)現(xiàn)，隨后一些研究人員在2014～2016年成功分離鑒定CPV-2c，并發(fā)現(xiàn)CPV-2c在傳播的同時(shí)，VP2 基因產(chǎn)生新的突變[11-13]，證明了CPV-2c 型在中國犬科動(dòng)物的繼續(xù)傳播發(fā)展。

本試驗(yàn)從長春某動(dòng)物醫(yī)院3 只患細(xì)小病毒犬只的腸道內(nèi)容物中，分離獲得3 株犬細(xì)小病毒，并對其VP2基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，以期了解長春市目前CPV的流行變化規(guī)律和分子特征，為更好地研究犬細(xì)小病毒以及該地區(qū)犬細(xì)小病毒的預(yù)防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 3 份犬細(xì)小病毒病料，來自吉林省長春市某動(dòng)物醫(yī)院。發(fā)病犬為3～5 月齡，臨床表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉和體溫升高等，利用Anigen Rapid CPV Ag Test Kit 檢測患病動(dòng)物糞便拭子，結(jié)果為陽性。

1.1.2 細(xì)胞及試劑 貓腎傳代細(xì)胞F81 株、CPV-VP2蛋白單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清、1640 細(xì)胞培養(yǎng)液、胰酶消化液、PBS 購自Gibco 公司；DNA Marke（rDL 2 000、DL 15 000）、DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、pEASY-Blunt Cloning Kit、Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞、TransStartFastPfu DNA Polymerase、EasyPurePlasmid MiniPrep Kit 等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Goat Anti-Mouse IgG FITC 購自北京博奧森生物有限公司；引物由生工生物（上海）工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 將采集糞便樣品用PBS 按1:3 比例稀釋，震蕩混勻10 min，10 000 r/min，4℃離心30 min，吸取上清，加入等體積氯仿，震蕩混勻15 min，12 000 r/min，4 ℃離心30 min，吸取上清使用0.22μm 濾膜過濾除菌后按4:1的比例添加雙抗（Penicillin-Streptomycin），4 ℃過夜放置，80℃保存。

1.2.2 病料DNA 提取及PCR 鑒定：2021 年12 月分離的3 株病毒命名為CPV-JL21-L1、CPV-JL21-L2、CPV-JL21-L3，將處理好樣品提取DNA，詳細(xì)步驟參照DNA提取試劑盒說明書提取基因組，80℃保存留用。

PCR 鑒定反應(yīng)體系（20μL）：模板DNA 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、Tap 酶10μL、ddH2O7μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，48℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 病毒分離培養(yǎng) 將生長良好的F81 細(xì)胞消化成懸液，按照體積比1:5 同步接種病料上清，另設(shè)正常細(xì)胞作為陰性對照，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長以及病變情況，盲傳3 代，若無細(xì)胞病變（Cytopathic effect,CPE）棄掉，產(chǎn)生CPE的細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80% CPE 時(shí)，反復(fù)凍融3 次后，收集病毒液，80 ℃保存。

1.2.4 血凝實(shí)驗(yàn)（HA）使用96 孔V型血凝板對CPV陽性第5 代細(xì)胞培養(yǎng)物上清液進(jìn)行HA 測定，每孔先加入25μL PBS 緩沖液，第1 排孔加入25μL 抗原，吹打混勻后依次倍比稀釋至11 排孔，棄掉25μL，第12孔為紅細(xì)胞對照，同時(shí)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)及陽性對照。每孔補(bǔ)充25μLPBS 后加入50μL1%豬紅細(xì)胞懸液，置于微量振蕩器震蕩搖勻1 min，4 ℃靜置40～60 min，判定結(jié)果。

1.2.5 病毒TCID50測定 將F81 細(xì)胞制備成2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，每孔100μL 均勻添加至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將第5 代病毒液在無血清1640 培養(yǎng)基中10 倍倍比稀釋至第11 個(gè)稀釋梯度，設(shè)置正常細(xì)胞對照組，每個(gè)稀釋度做4 個(gè)重復(fù)，按每個(gè)稀釋度每孔100μL同步接入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于35 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察記錄3～5 d 內(nèi)的細(xì)胞病變情況，按Reed-Muench 法計(jì)算病毒TCID50。

1.2.6 間接免疫熒光（IFA）將F81 細(xì)胞均勻鋪在96孔板中，按5%體積同步接種分離株病毒，置于35℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，棄去上清，PBST 清洗3 次，每次3 min；每孔添加預(yù)冷80%丙酮固定30～45 min，PBST 清洗3 次；使用5% BSA 封閉1h 后棄液，PBST 清洗5 次；加入一抗后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱作用1 h，PBST 清洗5 次；加入FITC 標(biāo)記的二抗，避光置于37℃恒溫培養(yǎng)箱作用1 h，PBST清洗5 次，將清洗后96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置熒光顯微鏡下觀察，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞作為陰性對照。

1.2.7 病毒電鏡觀察 病毒擴(kuò)增至30 mL，12 000 r/min離心15 min，使用0.22μm 濾膜過濾除去細(xì)胞碎片，送至電鏡觀察。

1.2.8 VP2 基因擴(kuò)增 根據(jù)GenBank 收錄的CPV-2株（GenBank 登錄號(hào)為M38245）基因序列，針對病毒VP2 基因區(qū)域，使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1）擴(kuò)增VP2 基因全長。

表1 引物序列Table 1 Primer Sequence

表2 分離CPV 的HA 效價(jià)測定結(jié)果Table 2 Separate CPV hemagglutination assay results

PCR 反應(yīng)體系（50μL）：上游引物1μL、下游引物1μL、Tap-Buffer 10μL、dNTPs 4μL、DNA Polymerase 1μL、模板DNA 3μL、ddH2O 30μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒進(jìn)行目的基因純化回收。

1.2.9 VP2 基因鏈接轉(zhuǎn)化及重組陽性質(zhì)粒鑒定 將純化后的產(chǎn)物鏈接到pEASY-Blunt 載體上，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，涂于含Amp+瓊脂培養(yǎng)板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落至含有5mL LB 培養(yǎng)液的試管中，200 rpm 37℃過夜培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶HindIII 和XhoI 進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確質(zhì)粒送往生工生物（上海）工程股份有限公司測序。

1.2.10 序列測定與分析 利用DNASTAR 軟件對基因組序列進(jìn)行拼接，截取VP2 基因與GenBank 數(shù)據(jù)庫中VP2 基因使用MEGA7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用MegAlign軟件分析VP2 蛋白氨基酸位點(diǎn)的變異情況。

2 結(jié)果

2.1 PCR鑒定

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，1、2、3 號(hào)樣品觀察到大約720 bp目的條帶，與4 號(hào)陽性對照結(jié)果相同，見圖1。

圖1 病毒PCR 鑒定結(jié)果Fig.1 PCR result of virus

2.2 病毒分離

將病料樣品分別接種至單層培養(yǎng)的F81 細(xì)胞，在接種后48～72 h左右呈現(xiàn)出不同程度的圓縮、聚集、拉網(wǎng)樣病變，對照組細(xì)胞輪廓清晰，表現(xiàn)正常，見圖2。

圖2 CPV 感染F81 細(xì)胞和正常的F81 細(xì)胞Fig.2 F81 cell infected with CPV and Healthy F81 cell

2.3 HA檢測結(jié)果

采用血凝實(shí)驗(yàn)對分離株的3、9、12、20 代病毒進(jìn)行血凝效價(jià)檢測，結(jié)果顯示，分離的3 株病毒第20 代血凝效價(jià)均保持在210～211。

2.4 TCID50 檢測結(jié)果

對培養(yǎng)出第5、20 代毒株進(jìn)行TCID50測定,根據(jù)Reed Muench 法計(jì)算，測得第5 代病毒含量在TCID50值為10-4.5～10-5.5/0.1 mL，第20 代病毒含量在TCID50值為10-7～10-7.5/0.1 mL。

2.5 間接免疫熒光結(jié)果

熒光顯微鏡下，正常細(xì)胞對照未見特異性熒光；3株CPV分離毒株可見明顯的特異性綠色熒光，如圖3。

圖3 間接免疫熒光結(jié)果Fig.3 The results of IFA

2.6 電鏡形態(tài)學(xué)觀察

病毒液濃縮后，置于電鏡下觀察，3 株CPV 分離株均可觀察到直徑為20～25 nm 無囊膜、呈立體對稱形態(tài)，與細(xì)小病毒的形態(tài)大小特征相符，見圖4。

圖4 病毒粒子電鏡下形態(tài)觀察Fig.4 Electron microscopy images of virus particles

2.7 分離株ＶＰ２基因擴(kuò)增及酶切鑒定結(jié)果

分離株VP2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，1、2、3 號(hào)樣品觀察到大約1 755 bp目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，見圖5；VP2 回收基因與Blunt 載體鏈接，酶切鑒定與預(yù)期目的片段大小相符，見圖6。

圖5 CPV μgene

圖6 pEASY-Blunt-VP2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.6 The identification of the pEASY-Blunt-VP2 vector by restriction endonuclease digestion

2.8 ＶＰ２基因進(jìn)化分析及同源性結(jié)果

使用MEGA7.0 軟件，將CPV-JL21-L1、CPV-JL21-L2、CPV-JL21-L3 株犬細(xì)小病毒與GenBank數(shù)據(jù)庫中15 株國內(nèi)和8 株國外CPV 的VP2 基因進(jìn)行比對，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，CPV-JL21-L1、CPV-JL21-L2、CPV-JL21-L3 與國內(nèi)江蘇、北京地區(qū)分離得到的CPV-2c 亞型毒株遺傳關(guān)系較近，同屬于CPV-2c 亞型毒株，與3 株疫苗株（DM381006.1、EU659116.1、EU914139.1）遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)（圖7）。

圖7 CPV VP2 核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹Fig.7 The nucleotide sequence genetic tree analysis of VP2 gene of CPV

2.9 同源性分析

將此次分離得到的3 株CPV 毒株與GenBank上已發(fā)表的數(shù)據(jù)庫中15 株國內(nèi)和8 株國外CPV的VP2基因進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，3 株CPV 毒株之間的核苷酸同源性都在99.8%，與3 株疫苗株DM381006.1、EU659116.1、EU914139.1 的同源性為98.6%～99.0%，與其他參考毒株同源性為98.6%～99.9%（圖8）。

圖8 CPV 毒株μgene of the CPV isolate

2.10 氨基酸變異分析

CPV VP2 基因共編碼584 個(gè)氨基酸，通過核苷酸序列翻譯分離的3 株病毒，并與GenBank 數(shù)據(jù)庫中23 株具有代表性CPV 毒株VP2 基因所推導(dǎo)的氨基酸序列，運(yùn)用DNASTAR 中Clustal W 方法進(jìn)行相互對比，見表3。由表3 可知，本試驗(yàn)中分離的3 株病毒株屬于CPV-2c 亞型，與GenBank 中參考CPV-2c 氨基酸序列相比，分離株CPV-JL21-L1、CPV-JL21-L3 氨基酸序列80L、101T、267Y、297A、300G、324I、375D、426E、555V 位點(diǎn)與國內(nèi)流行株相同，CPV-JL21-L2 與國內(nèi)參考氨基酸序列相比，有Y267F 一處突變，總體來看，國外分離毒株CPV-2c 亞型在267 位多數(shù)為F，國內(nèi)多為Y。

表3 CPV VP2 蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)比較Table 3 Comparison of key amino acid sites of CPV VP2 protein

3 討論

隨著寵物行業(yè)的快速發(fā)展，寵物犬的養(yǎng)殖數(shù)量日益增加，犬細(xì)小病毒性腹瀉是犬科動(dòng)物最嚴(yán)重傳染病之一，近些年來一直倍受關(guān)注。自細(xì)小病毒發(fā)現(xiàn)以來，我國每年因感染CPV死亡的犬科動(dòng)物逐年上升，CPV的主要宿主為幼犬，幼犬感染CPV 后，發(fā)病率可達(dá)90%，死亡率為35%左右[14]，嚴(yán)重影響了養(yǎng)犬業(yè)的健康發(fā)展[15]。因此，CPV 的流行病學(xué)調(diào)查以及病毒遺傳進(jìn)化方向的研究，對CPV 的防控以及CPV 疫苗的研發(fā)都有著重要意義。

本試驗(yàn)從患病犬糞便中成功分離3 株CPV毒株，經(jīng)PCR 實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞病變、電鏡觀察、血凝實(shí)驗(yàn)、間接免疫熒光以及VP2 基因測序分析，證明分離毒株確為CPV，將其命名為CPV-JL21-L1、CPV-JL21-L2、CPVJL21-L3，通過與GenBank 中國內(nèi)外23 株CPV 流行毒株VP2參考序列同源性及進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，CPVJL21-L1、CPV-JL21-L2、CPV-JL21-L3 分離株均為CPV-2c 亞型，分離株CPV-JL21-L1、PV-JL-L3 與CPV-2c(MK895490.1)BJ、CPV-2c(MF001437.1)JS、CPV-2c (KP260509.1) JL、CPV-2c (KR611522.1) JL、CPV-2c (KT162014.1) JL 株的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)一致，CPV-JL21-L2 僅出現(xiàn)Y267F不一致。VP2 是犬細(xì)小病毒的主要抗原決定簇，與宿主免疫反應(yīng)有關(guān)，VP2 基因的少量突變可能導(dǎo)致致病性的改變[16]。Phe267Tyr突變存在于吉林省早期新CPV-2a 分離株2010（GU380303）中，隨后于2013 也有相關(guān)報(bào)道。值得關(guān)注的是，VP2 蛋白的267 位點(diǎn)氨基酸是G 和H 鏈之間GHloop 區(qū)的組成部分，且位于衣殼面[17,18]。一些研究表明，目前商品化疫苗都是CPV-2 和CPV-2b型疫苗，對CPV-2c型毒株不能起到很好的保護(hù)效率[19]。JIANG等[20]對CPV 遺傳進(jìn)化的研究中指出，國內(nèi)的CPV-2c型正以其特有的方向遺傳進(jìn)化。因此，國內(nèi)CPV 267位點(diǎn)氨基酸取代可能導(dǎo)致其抗原性和免疫原性的改變，還需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

綜上所述，本研究從吉林省長春地區(qū)某動(dòng)物醫(yī)院患病犬糞便樣品中分離得到3 株CPV-2c 亞型毒株，與目前國內(nèi)流行毒株VP2 基因有較高的同源性，與近幾年吉林省內(nèi)CPV-2c 亞型發(fā)病和檢出率結(jié)果大致相同，因此，應(yīng)該加強(qiáng)對東北地區(qū)CPV-2c基因型的監(jiān)測，同時(shí)本研究結(jié)果為了解長春地區(qū)CPV 遺傳變化及開發(fā)CPV 新型疫苗提供了參考。