基于生物信息學、網絡藥理學及分子對接探討人參調控肺腺癌的鐵死亡機制

汪雪瑩，楊銀莉，潘戰宇，姜戰勝※

（1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.天津醫科大學腫瘤醫院國家腫瘤臨床醫學研究中心天津市“腫瘤防治”重點實驗室天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心中西醫結合科，天津 300060）

肺癌的發病率和死亡率均居世界首位[1]，主要包括小細胞肺癌（Small cell lung cancer,SCLC）和非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）。NSCLC患者約占所有肺癌患者的80%，其中肺腺癌（Lung adenocarcinoma,LUAD）是NSCLC 的主要組織學亞型，占所有肺癌病例的40%以上[2]。

鐵死亡是一種不同于細胞凋亡、焦亡和壞死的程序性細胞死亡，這一過程特點是依賴鐵離子及活性氧誘導脂質過氧化物堆積[3]。有證據表明，鐵死亡在癌癥尤其是肺癌的進展中起著至關重要的作用，特別是在肺癌中常常出現鐵死亡被抑制的現象[4]。肺部組織相對于其他組織長期處于高氧濃度環境中，這種特殊環境使得肺部腫瘤需要承受很大的氧化壓力，肺癌細胞為了避免在轉化過程中出現被易化和強化的鐵死亡，采取了多種措施提高鐵死亡的誘導閾值，從而導致鐵死亡受抑，進而促進肺癌的發生和發展[5]。

人參為五加科植物，具有大補元氣，復脈固脫，補脾益肺，生津安神的功效。有大量研究證實，人參及其主要活性成分在治療肺癌的發生和發展中發揮重要作用[6-8]。有研究顯示，紅參作為人參蒸熟、曬干或烘干后的產物，其主要成分紅參多糖可以顯著抑制肺癌或乳腺癌細胞的增殖并加速誘導鐵死亡，使乳酸脫氫酶釋放、脂質過氧化物積累[9]。這些研究表明人參、鐵死亡與肺癌之間存在聯系，然而迄今為止，人參調控鐵死亡治療肺癌尤其是LUAD的機制尚不十分明確。因此，本研究擬通過識別人參調控LUAD的鐵死亡基因并構建更準確的預后模型，闡述人參調控鐵死亡治療LUAD 可能的作用機制，以期為后續研究提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 人參活性成分的獲取和靶點預測

在TCMSP 數據庫（https://tcmsp-e.com/）中以生物口服利用度（Oral bioavailability,OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness,DL）≥0.18 為篩選條件；在ETCM數據庫（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/）中以score ≥0.8 為篩選條件；在Batman-TCM 數據庫（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）中以P ＜0.05、score ≥10 為篩選條件，分別下載人參活性成分及其作用靶基因，并通過Cytoscape v3.9.0 軟件對人參活性成分及相關靶基因進行分析，繪制人參活性成分－靶點網絡圖，人參活性成分度值圖。

1.2 鑒定人參治療LUAD的鐵死亡基因

從TCGA數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載了574 名LUAD 患者的RNA 測序（RNA-seq）FPKM數據集和臨床信息，運行R軟件“edgeR、gplots”程序包，以Fold change ＞1、P ＜0.05 為過濾條件對LUAD 患者的RNA-seq 基因進行差異基因篩選。從FerrDb 數據庫（http://www.datjar.com:40013/bt2104/）下載鐵死亡相關基因，并通過Draw Veen Contents 在線工具篩選出人參作用靶基因、鐵死亡基因和LUAD差異基因的交集基因，并對交集基因的差異表達進行可視化。

1.3 GO功能分析與KEGG通路注釋分析

通過David 數據庫對交集基因分別進行基因本體（GO）功能分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路注釋分析，以P ＜0.05 為篩選條件，進行可視化。

1.4 構建預后風險模型并篩選關鍵鐵死亡基因

將交集基因相關的TCGA 數據集與患者臨床信息合并，去除正常組織數據和脫落數據后，使用R 軟件“survival”程序包進行單因素Cox分析，以P＜0.05為條件篩選交集基因中與總體生存期（OS）有關的具有預后價值的基因。為了進一步篩選人參治療LUAD的關鍵鐵死亡基因，在相關預后基因的基礎上，采用R軟件“glmnet、survival”程序包進行Lasso回歸分析，構建預后風險模型，篩選出關鍵鐵死亡基因，并進行基因的相關性分析。

1.5 評估預后風險模型

通過以下公式計算風險評分：Riskscore=coef（關鍵鐵死亡基因1）expr（關鍵鐵死亡基因1）+coef（關鍵鐵死亡基因2）expr（關鍵鐵死亡基因2）+…+coef（關鍵鐵死亡基因n）expr（關鍵鐵死亡基因n）。根據風險評分中位數將患者劃分為“高風險”和“低風險”組，構建風險曲線和散點圖，觀察風險評分對患者死亡與存活狀態的影響，利用R 軟件“survival”包對兩組患者進行生存分析，通過建立時間依賴ROC 曲線以評估預后模型的可靠程度，應用R軟件“ggplot2、Rtsne”程序包主成分分析（PCA）和分布式隨機鄰居嵌入（t-SNE）分析，以證明該模型的分組能力。

1.6 分子對接

通過Pubchem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載人參活性成分的化學結構，PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）下載關鍵鐵基因的靶點蛋白，分別將其導入AutoDock Vina 進行分子對接并預測分子與靶點結合能。

2 結果與分析

2.1 人參活性成分和作用靶點的篩選結果

從中藥數據庫中共篩選出人參活性成分77 個和人參作用靶點1 676 個（圖1A）；人參活性成分，根據度值排序結果，見圖1B。

圖1 人參活性成分-靶點分析圖Fig.1 Ginseng active ingredient-target analysis diagram

2.2 人參治療LUAD的鐵死亡基因鑒定結果

從TCGA 數據庫中共篩選出3 300 個LUAD 差異基因，其中包括1 166 個上調基因，2 134 個下調基因；通過對中藥數據庫中篩選出1 676 個人參作用靶點、FerrDb數據庫中篩選出388個鐵死亡基因和TCGA數據庫中篩選出的3 300 個LUAD 差異基因，Venn分析后發現29 個人參治療LUAD 的鐵死亡基因（圖2A），其中包括9個上調基因，20個下調基因，見圖2B。

圖2 人參治療LUAD 的鐵死亡基因的鑒定結果圖Fig.2 Identification results of ferroptosis gene of Ginseng in treating LUAD

2.3 富集分析結果

針對29 個交集靶點通過GO 功能分析可知，在P ＜0.05水平篩選出生物過程（Biological process,BP）條目59 個，其中涉及RNA 聚合酶II 啟動子轉錄的正調控、基因表達的正調控和凋亡過程的負調控等；細胞組分（Cellular component,CC）條目8 個，其中涉及基底外側膜、細胞膜穴樣凹陷和黑素體等；分子功能（Molecular function,MF）條目14 個，其中涉及蛋白質結合、蛋白異源二聚化活性和酶結合等；根據基因數進行排序，分別將前10 位的條目進行可視化，見圖3A。

圖3 富集分析結果圖Fig.3 Enrichment analysis results

通過KEGG 分析獲得32 條信號通路，分別對前8 條疾病途徑和前7 條信號通路進行可視化（圖3B），這些信號通路多與免疫炎癥和低氧相關，提示人參治療LUAD 的鐵基因可能通過這些通路發揮作用。

2.4 相關預后基因篩選結果

去除正常組織數據和脫落數據后，剩余499 列LUAD 患者信息。對余下499 列患者進行分析，根據單因素Cox 回歸分析篩選出6 個影響總體生存期（OS）預后的基因：RRM2、AURKA、SLC2A1、TXNRD1、TLR4 和CAV1。在預后基因的基礎上進行Lasso 回歸分析構建預后風險模型，發現由SLC2A1、RRM2、CAV1、TXNRD1 和TLR4 組成的預后風險模型最為穩定（圖4A），這5 個基因可能是人參調節LUAD 的關鍵鐵死亡基因。其中，TLR4 是LUAD 預后保護因素，SLC2A1、RRM2、CAV1 和TXNRD1 可能是LUAD 預后危險因素（圖4B）?；蛑g相關性分析發現TLR4 與SLC2A1、RRM2、CAV1 和TXNRD1呈負相關；SLC2A1、RRM2、CAV1 和TXNRD1 之間呈正相關，見圖4C。

圖4 風險預后模型和關鍵鐵死亡基因分析結果圖Fig.4 Risk prognostic model and analysis results of key ferroptosis genes

2.5 鐵死亡基因預后模型的評估結果

根據風險評分中位值，將樣本分為高風險組（n=249 例）和低風險組（n=250 例），高風險組患者死亡人數高于低風險組（圖5A 和5B）。KM 生存曲線分析表明，遠期低風險組的生存時間長于高風險組，并具有統計學意義（圖5C）；ROC 曲線（AUC=0.676）證明該預后模型具有可靠性（圖5D）；PCA 和t-SNE 雖有待優化，但基本證明該模型能將高風險組和低風險組樣本區分（圖5E-F）。經評估證明RRM2、SLC2A1、TXNRD1、TLR4 和CAV1 這5 個關鍵鐵死亡基因對LUAD 的預后影響顯著且模型穩定可靠。

圖5 風險預后模型評估結果Fig.5 Risk prognostic model assessment results

2.6 分子對接結果

大多數中藥的皂苷、多糖和揮發油成分對肺癌具有一定的干預作用，皂苷類成分和多糖類成分主要通過促進腫瘤細胞凋亡從而抑制腫瘤生長[10]。人參化學成分有皂苷、有機酸、揮發油和多糖等[11]。根據人參化學成分分類，度值排名前3 位的活性成分作為配體，5個關鍵鐵死亡基因作為受體，進行分子對接。一般認為，結合能小于0 說明配體與受體可以自發結合，結合能≤ 20.92 kJ/mol 表示具有較好的結合性，同時所需的能量越少，代表配體與受體的相互作用的親和力越強，構象越穩定[12,13]。通過AutoDock Vina 分析，發現人參的重要活性成分與關鍵鐵死亡基因均能自發結合，見表1。

表1 人參主要活性成分與關鍵鐵死亡基因結合能量表Table 1 Energy table of main active components of ginseng combined with ferroptosis genes 單位：kJ/mol

3 討論

本研究通過對人參作用靶點、鐵死亡基因和LUAD 差異基因進行Venn 分析發現29 個人參治療LUAD 的鐵死亡基因。通過KEGG 信號通路分析可知，Toll 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路等可能是人參調控鐵死亡基因治療LUAD的主要途徑?；贚asso回歸分析構建了一個預后模型，分別由5 個鐵死亡相關基因（SLC2A1、RRM2、CAV1、TXNRD1 和TLR4）組成，根據風險評分中位值將樣本分為高風險組和低風險組，KM 生存曲線和ROC 曲線證明這5 個關鍵鐵死亡基因對LUAD 的預后影響顯著且模型具有可靠性，PCA 和t-SNE 證明該模型基本能將高風險組和低風險組樣本區分，但后續需要基礎試驗的進一步優化及驗證。分子對接結果顯示，人參的主要活性成分與5 個鐵死亡關鍵基因均能自發結合。由此推斷這5 個鐵死亡關鍵基因是人參通過調節鐵死亡途徑治療LUAD 的關鍵靶點。

鐵死亡在肺癌的發生和發展中起雙重作用，一方面，藥物可以通過半胱氨酸耗竭或抑制GPX4 來誘導鐵死亡，從而遏制NSCLC 細胞的生長；另一方面，鐵死亡可以引起免疫抑制，通過介導炎癥反應促使NSCLC腫瘤生長[14]。人參是一種天然抗氧化劑，抗氧化劑的發現與天然存在的非酶抗氧化劑有關，后者形成完整的防御系統以防止體內氧化應激，而氧化應激被證明與鐵死亡相關[15,16]。雙氫青蒿素作為天然抗氧化劑青蒿的主要提取物，已經被證實與Ce6 光動力療法聯合應用可以抑制GPX4，升高活性氧，誘發鐵死亡，抑制肺癌細胞的活力[17,18]，為人參調控鐵死亡治療LUAD的機制提供了參考依據。

有研究發現，炎癥在腫瘤進展中有著不可忽視的作用，Toll 樣受體介導的疾病中多伴隨著炎癥反應的發生[19]。Toll樣受體4 信號轉導通過活性氧對NSCLC的生長和轉移具有重要作用，其主要機制是上調NSCLC細胞中miR-21 促進原發性NSCLC 的生長，而通過清除活性氧可以減少原發性NSCLC 細胞中miR-21的上調從而減慢NSCLC 的生長。NADPH 氧化酶對于Toll樣受體4 信號增強的NSCLC轉移至關重要[20,21]。一旦產生了過量的活性氧，超過細胞自身抗氧化能力，活性氧可能發生氧化應激反應，從而損害細胞內的線粒體、內質網及核酸等，最后導致細胞死亡[22]。HIF-1信號通路在細胞、組織和器官的低氧損傷和適應過程中有關鍵的調控作用，低氧可以增加HIF-1 的穩定性，促進HIF-1 與低氧反應元件的結合，從而誘導低氧靶基因的激活。有研究證實EGLN1 基因和c-Myc 基因通過抑制HIF-1α直接激活淋巴特異性解旋酶的表達，淋巴特異性解旋酶與WDR76 相互作用，通過激活脂質代謝相關基因GLUT1 以及與鐵死亡相關的基因SCD1 和FADS2 參與Warburg 效應抑制鐵死亡，促進NSCLC 的進展[23,24]。由此可見，Toll 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路與LUAD 鐵死亡有著緊密聯系。

RRM2、SLC2A1 和TXNRD1 在一些研究中被證實可能與鐵死亡和肺癌相關。RRM2 是核糖核苷酸還原酶的兩個不同亞基之一，該還原酶催化核糖核苷酸形成脫氧核糖核苷酸，并以細胞周期依賴性的方式調節編碼蛋白（M2）合成。敲除RRM2 能夠通過介導鐵死亡影響肺腺癌細胞的增殖，而鐵死亡抑制劑Fer-1可以逆轉RRM2 敲除后的抗腫瘤效果。由此證實了RRM2 不僅是鐵死亡的標志基因，也是鐵死亡的抑制基因[25]。SLC2A1 介導的葡萄糖攝取促進糖酵解，從而促進丙酮酸氧化，促進三羧酸循環，并刺激脂肪酸合成，最終加速誘導鐵死亡[26]。在肺癌患者的癌前病變和腫瘤中檢測到SLC2A1 的過表達，發現滅活SLC2A1會影響癌細胞中的糖酵解途徑，使體內、外的肺癌細胞減少[27]。TXNRD1 參與抗氧化防御，并與癌細胞的耐藥性相關，受TXNRD1 調節的代謝途徑在癌癥中至關重要。當細胞內半胱氨酸充足時，TXNRD1 和GSH/GPX4 共同作用，維持細胞內氧化還原平衡，避免鐵死亡。當細胞內半胱氨酸缺乏時，半胱氨酸耗竭會引起一定程度的TXNRD1 酶活性和GSH/GPX4 水平下降，導致氧化水平急劇升高，發生鐵死亡[28-30]。

生物信息學、網絡藥理學和分子對接為新藥研發及臨床用藥提供理論依據，但是目前仍存在局限性，主要有：首先每個數據庫收納的藥物活性成分不同，用不同數據庫預測的作用靶點可能存在差異；其次受樣本量限制，預后模型評估結果可能與真實情況存在誤差；最后相關疾病的具體分子機制尚不完全清楚，因此，分子對接等技術可能與實際情況存在區別，需要后續進行基礎試驗驗證。

綜上所述，人參可通過SLC2A1、RRM2、CAV1、TXNRD1 和TLR4 等關鍵鐵死亡基因介導Toll 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路等發揮治療LUAD 的作用，為進一步研究提供了理論依據和參考。