兩種玉竹根莖顯微形態及同工酶譜帶比對研究

吳杰，寧偉

（1.沈陽醫學院公共衛生學院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽農業大學園藝學院，遼寧 沈陽 110161）

玉竹[Polygonatum odoratum(Mill.)Druce]為百合科黃精屬多年生草本植物，其根莖的應用歷史久遠。玉竹性微寒，味甘，有養陰潤燥、生津止渴之功效[1-3]。據現代藥理研究，玉竹中主要化學成分為多糖類化合物，玉竹具有提高人體免疫力、強心、降血脂、降血糖及延長動物壽命等作用[4-6]。在我國玉竹主要有南北兩大產區[7]，本研究選擇北方遼寧省寬甸縣主產區的寬甸玉竹和湖南新邵縣玉竹藥材基地主產區的邵縣玉竹為實驗材料，具有栽培藥材的道地代表性。現對兩類玉竹品種的顯微結構和POD 同工酶譜帶進行比對，分析寬甸玉竹與邵縣玉竹顯微結構和POD同工酶譜帶差異，進而來區分南北玉竹結構差異及遺傳特性，為進一步開發利用玉竹資源奠定理論基礎，同時也為進一步開發玉竹成分提供理論依據。

1 試驗材料與儀器

1.1 主要儀器

試驗儀器為OLYMPUS 臺式顯微鏡（BH 型，日本奧林巴斯），高速冰凍離心機（TGL-16EI，山東博科），電泳儀（DYCZ-24DN型，北京六一），垂直平板電泳槽（JY-SCZ2 型，北京六一），40 W日光燈具一套（上海燈具廠），酸度計（上海儀器儀表有限公司），Brand 移液器（德國普蘭德）等。

1.2 材料與藥品

1.2.1 材料 寬甸玉竹新鮮根莖來源于遼寧省丹東市寬甸縣玉竹生產基地，稱為寬甸玉竹（屬于關玉竹中一種）；邵縣玉竹新鮮根莖來源于湖南新邵縣玉竹藥材基地，稱為邵縣玉竹（屬于湘玉竹中一種）；兩種中藥玉竹均為市場常見藥材，具有藥材可比性。

1.2.2 藥品 FAA 固定液（50%～70%酒精90 mL，37%～40%甲醛水溶液5 mL，冰醋酸5 mL）；二甲苯、酒精、石蠟（48～50 ℃）、明膠、染色液0.5%～1%的番紅酒精（70%酒精）+0.1%～0.2%的固綠酒精（95%酒精）、加拿大樹膠、5 mol/L磷酸緩沖液、Tris、四甲基乙二胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、核黃素、鹽酸、甘氨酸、聯苯胺、醋酸、EDTA-Na、氯化銨、雙氧水（以上試劑均為分析試劑，購自沈陽國藥）。

2 試驗方法

2.1 寬甸玉竹與邵縣玉竹根莖石蠟切片觀察

試驗取材為寬甸玉竹與邵縣玉竹1 年生新鮮根莖進行石蠟切片觀察。利用常規石蠟切片與番紅－固綠對染法，其步驟為固定→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→粘片→脫蠟→復水→番紅、固綠染色→封藏。切片厚度為10μm，用加拿大樹膠封片，BH 型OLYMPUS 顯微鏡觀察并照相[8]。

2.2 寬甸玉竹與邵縣玉竹POD同工酶檢測

2.2.1 酶液的制備 將采收的寬甸玉竹根莖與購買的邵縣玉竹新鮮根莖用蒸餾水洗凈并吸干水分，各稱取0.5 g 根莖于研缽中，用0.5×10-2mol/L 磷酸緩沖液pH 7.8 在冰浴中研磨勻漿，并定容至5 mL，在4 ℃下以13 000 g 離心20 min，取上清液即為酶粗提液。

2.2.2 電泳 采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為10%（pH 8.9），濃縮膠濃度（pH 6.7），電極緩沖液為pH 8.3 的Tris 每孔點樣量為40μL，加入2 滴溴酚藍指示電泳前沿。于4 ℃冰箱內恒壓電泳，濃縮膠中為112V，待指示劑進入分離膠后增大至210V，電泳約需4 h。

2.2.3 染色 過氧化物同工酶染色用醋酸 聯苯胺染色法染色。經染色膠版上出現棕褐色清晰酶帶，用蒸餾水漂洗后置7.5%冰醋酸中脫色、固定、照相和作圖。按Rf=酶帶遷移距離/指示劑遷移距離記錄Rf 值。并利用SPSS 19.1.1 軟件進行數據分析[6]。

3 試驗結果

3.1 玉竹形態學觀察結果

從寬甸玉竹與邵縣玉竹根莖的表面形態學觀察可以看出，新鮮的寬甸玉竹根莖相對較細且顏色為白色，而邵縣玉竹根莖較粗且顏色為棕黃色。寬甸玉竹與邵縣玉竹的根莖均為圓柱形，且有分支，但寬甸玉竹的表面玉白色或淡白色，直徑均值為0.5～1.6 cm，節明顯，節間距平均值為3.5～9.6 cm，而邵縣玉竹直徑均值為1.2～4.7 cm，節明顯，節間距平均值為5.3～11.4 cm。一般寬甸玉竹根莖比邵縣玉竹根莖細小，且寬甸玉竹顏色較淺，分支較邵縣玉竹的多且粗，多呈分支狀，而邵縣玉竹的多為須根狀，見圖1。

圖1 寬甸玉竹和邵縣玉竹1～3 年生根莖比對圖Fig.1 Comparison of 1～3 year roots and stems of Kuandian and Shaoxian

3.2 玉竹根莖的石蠟切片觀察

3.2.1 玉竹根莖石蠟切片結果 基于寬甸玉竹與邵縣玉竹形態學的明顯差異，進一步對其顯微結構進行觀察，石蠟切片觀察結果表明，寬甸玉竹的表皮厚度平均為2.24×10-2mm；薄壁組織厚度平均為8.69×10-2mm；微管組織厚度平均為1.561mm；邵縣玉竹的表皮厚度平均為3.85×10-2mm；薄壁組織厚度平均為5.36×10-2mm；微管組織厚度平均為3.114 mm，見圖2。

圖2 寬甸玉竹和邵縣玉竹根莖石蠟切片橫縱切面Fig.2 Transverse and longitudinal section of paraffin section of rhizome of Kuandian and Shaoxian

試驗基于寬甸玉竹與邵縣玉竹根莖形態學存在很大差異的基礎上，對寬甸玉竹與邵縣玉竹根莖進行顯微形態學石蠟切片的觀察，目的是為了觀察確定寬甸玉竹與邵縣玉竹的形成層主要結構，分為表皮、薄壁組織和微管組織，寬甸玉竹與邵縣玉竹的新鮮根莖的主要顯微形態學結構基本一致，這與寬甸玉竹和邵縣玉竹的本身生長特性相符合。

3.2.2 玉竹根莖石蠟切片顯著性分析 由上述玉竹新鮮根莖石蠟切片觀察測定結果進行寬甸玉竹與邵縣玉竹種間的表皮、薄壁組織和微管組織進行差異顯著性的方差分析，進一步為判斷寬甸玉竹與邵縣玉竹種間的差異顯著性提供可靠依據，其方差分析結果表明，寬甸玉竹與邵縣玉竹種間石蠟切片結構表皮、薄壁組織和微管組織結構間均存在顯著差異，見表1。

表1 寬甸玉竹與邵縣玉竹石蠟切片結構方差分析Table 1 Anova of paraffin section structure of Kuandian and Shaoxian

表1 寬甸玉竹與邵縣玉竹石蠟切片結構方差分析Table 1 Anova of paraffin section structure of Kuandian and Shaoxian

注：**代表極顯著差異。Note:**Represents a very significant difference.

3.3 玉竹POD同工酶譜帶分析

試驗基于對寬甸玉竹與邵縣玉竹根莖形態學和顯微結構觀察的基礎上，進一步對其POD 同工酶電泳譜帶進行檢測，以達到區分鑒定寬甸玉竹與邵縣玉竹分類學地位的目的，其POD 譜帶，見圖3。

圖3 寬甸玉竹與邵縣玉竹POD 同工酶電泳譜帶及模式圖Fig.3 POD isozyme electrophoretic bands and patterns of Kuandian and Shaoxian

由圖3 可以看出，寬甸玉竹與邵縣玉竹的過氧化物同工酶譜帶從負極到正極共分離出4 條譜帶，且所有譜帶的Rf 值都小于0.5。寬甸玉竹與邵縣玉竹過氧化物（POD）同工酶譜帶相似度達80%以上，但是寬甸玉竹的過氧化物同工酶譜帶在Rf=0.03 與Rf=0.16時譜帶顏色很淺淡，而相同Rf 值時邵縣玉竹譜帶顏色很深，說明寬甸玉竹中的某些蛋白含量低于邵縣玉竹。

4 討論

4.1 寬甸玉竹與邵縣玉竹顯微結構區別顯著

在《中國植物志》上描述玉竹，分布于歐亞大陸的溫帶，變異甚大，葉下面脈上和花絲均可平滑至具乳頭狀突起，不同作者對不同類型曾給予不同等級的名稱，由于對它的變異規律尚未十分掌握，我們在植物志中，對它的種下等級不再細分[10-15]。本研究采用具有南北區域代表性的寬甸玉竹（屬于關玉竹中的一種）和邵縣玉竹（屬于湘玉竹中一種），且這兩種玉竹均是大量銷售于河北安國和安徽亳州的主要玉竹品種。因此，本研究受藥材企業委托，將這南北兩大主產區中藥玉竹根莖進行比對研究，我們跟蹤3 年，分別采集1 年生、2年生和3 年生玉竹根莖進行形態學比對，并進行同工酶圖譜比對。針對《中國植物志》中玉竹種屬分類問題的混淆，我們主要開展以藥產地為依托的中藥材形態學比對工作，因此可忽略中間分類問題的混淆。本試驗對寬甸玉竹與邵縣玉竹形態學進行比對，結果表明新鮮的寬甸玉竹根莖相對較細且顏色為白色，而邵縣玉竹根莖較粗且顏色為棕黃色。寬甸玉竹與邵縣玉竹的根莖均為圓柱形，且有分支。但寬甸玉竹直徑均值為0.5～1.6 cm，節明顯，節間距平均值為3.5～9.6 cm；邵縣玉竹直徑均值為1.2～4.7 cm，節明顯，節間距平均值為5.3～11.4 cm。

本研究在對寬甸玉竹和邵縣玉竹新鮮根莖橫切面和縱切面石蠟切片觀察的基礎上進行其顯微結構分析鑒定，結果顯示寬甸玉竹與邵縣玉竹的切片結構一致，均有表皮、薄壁組織和微管組織組成。結果表明，寬甸玉竹的表皮和薄壁組織結構比邵縣玉竹的厚且相對疏松，而微管組織比邵縣玉竹的薄且致密，且均存在極顯著差異，這主要是由于寬甸玉竹與邵縣玉竹的種間差異和生長環境條件不同所導致的。邵縣玉竹相對于寬甸玉竹而言，其結構微管組織相對較厚，且組織細胞較密，細胞間隙相對較小，這也符合邵縣玉竹比寬甸玉竹粗壯堅硬的特性[16-18]。

4.2 寬甸玉竹與邵縣玉竹同工酶譜帶比對

由于寬甸玉竹與邵縣玉竹在形態上就存在著一些差異，且同工酶是編碼基因不同而產生的多種分子結構的酶，基因的微小變化都會引起同工酶的變化[19,20]。因此，可從同工酶譜的變化及酶譜特征了解品種間的種間差異，但僅憑同工酶圖譜尚無法證明其種間親緣關系。應該綜合考慮AFLP、SSR、ISSR 和PARD 等分子標記研究結果，來進行玉竹種間親緣關系鑒定。本試驗說明了寬甸玉竹與邵縣玉竹之間的品種，屬于同一種屬植物，存在的差異為種內遺傳多樣性差異。

本研究對于寬甸玉竹與邵縣玉竹的石蠟切片顯微結構觀察和POD 同工酶電泳譜帶分析技術進行分類學地位鑒定，并確定二者之間的親緣關系，得出寬甸玉竹與邵縣玉竹為同一種屬植物但存在一定的種內差異。這主要因為寬甸玉竹與邵縣玉竹生長產地的地域性差距形成了不同的生態居群，環境原因是造成寬甸玉竹與邵縣玉竹形態結構及同工酶電泳譜帶不同的根本原因。本研究為中藥玉竹產地分類提供理論基礎，也為進一步開發利用中藥玉竹資源提供理論依據。