基于DNA橋連氧化石墨烯的Fpg熒光檢測

杜 佳 原, 邢 逸 飛, 趙 慧 敏

(大連理工大學 環境學院 工業生態與環境工程教育部重點實驗室,遼寧 大連 116024 )

0 引 言

紫外線、電離輻射等外源因素和脂質過氧化產物、甲基化劑等內源因素[1]均會導致機體發生氧化應激,引起活性氧(ROS)的異常產生與釋放[2].而過量的ROS會攻擊脫氧核糖核酸(DNA)的化學結構,造成一定程度的DNA氧化損傷.其中,在堿基修飾中研究最為廣泛的是鳥嘌呤(G)損傷,這一過程是將鳥嘌呤轉變為8-氧鳥嘌呤(8-oxoG).如果不對其進行修復,在DNA復制過程中就無法保證基因組的完整性[3-5].這樣不僅會引起細胞衰老和死亡,甚至會造成細胞的癌變[6-7].然而,細胞會分泌DNA糖基化酶,特異性地識別并切除特定的受損堿基[8-10].其中,甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶(Fpg)可以特異性識別并切除8-oxoG堿基.但Fpg活性的失常會導致8-oxoG堿基切除受阻,因此,對Fpg的酶活性和濃度進行測定與評估可以反映鳥嘌呤受損程度,為污染物毒性效應評價提供技術手段.

Fpg的常規定量檢測方法有酶聯免疫吸附法[11]、高效液相色譜法[12]、彗星實驗[13]和凝膠電泳法[14]等.目前已經開發出其他簡便快捷的方法,例如比色法[15]、電化學法[16]和熒光法[17-19]等.其中熒光檢測Fpg的方法具有較強的特異性和選擇性等優點,已得到廣泛應用.但該方法仍存在需要多酶協同、反應較為復雜、耗時較長和背景值高等不足之處.

近幾年來,氧化石墨烯在熒光傳感領域被廣泛應用[20-21].單鏈DNA可通過π-π堆積作用及靜電作用固定在氧化石墨烯表面,且兩者相互作用力較強.由于氧化石墨烯具有較大的比表面積和較強的熒光淬滅性能,可以提供更多的附著位點,從而連接大量單鏈DNA并淬滅單鏈DNA上標記的熒光染料(如FAM基團),因此本文利用氧化石墨烯固定單鏈DNA作用力強度不同的原理,構建簡單快速靈敏的檢測Fpg的熒光傳感方法.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

(1)實驗試劑

濃硫酸(H2SO4,>98%)、石墨粉(化學純)、高錳酸鉀(KMnO4,分析純)、硝酸鈉(NaNO3,≥99%)、過氧化氫(H2O2,30%)購于天津市大茂化學試劑廠,三(羥甲基)氨基甲烷(Tris,>99%)、氯化鈉(NaCl,≥99%)、六水氯化鎂(MgCl2·6H2O,≥98%)、核糖核酸酶A(RNase A)購于生工生物工程(上海)股份有限公司,甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶、尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、人源脫嘌呤脫嘧啶核酸內切酶1(APE 1)、核糖核酸酶Ⅰ(RNase Ⅰ)、10× NEBuffer 1(10 mmol/L雙(2-羥基乙胺基)三(羥甲基)甲烷鹽酸鹽、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L二硫蘇糖醇)、10 mg/mL牛血清蛋白(BSA)均購于New England Biolabs公司.胎牛血清購于美國Gibco公司.實驗所用的Tris-HCl緩沖溶液含有20 mmol/L Tris、200 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2·6H2O(pH=7.0).實驗所用超純水均為科瑞峰實驗超純水系統產生.實驗所用器材與用水均通過蒸汽滅菌鍋滅菌.寡核苷酸鏈購于生工生物工程(上海)股份有限公司,其序列為5′-C*G*A*CCGGCTCGGAGTA/i8oxodG/GA*A*T*G-FAM-3′,并將其命名為T1鏈.

(2)實驗儀器

通過掃描電子顯微鏡(SEM,Hitachi,S-4800)對氧化石墨烯的表面微觀形貌進行表征;通過傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR,ThermoFisher 6700)對材料的官能團進行表征;采用熒光光譜儀(Hitachi,F7000)檢測反應體系的熒光強度;采用CBS可調式單/雙面垂直電泳槽(美國C.B.S.公司)對核酸進行凝膠電泳,并通過多功能激光成像儀(Amersham Typhoon)進行凝膠成像.

1.2 氧化石墨烯的制備

本實驗采用Hummers法制備氧化石墨烯,主要過程如下:將23 mL濃硫酸置于錐形瓶中并攪拌,將1 g石墨粉與0.5 g NaNO3混合后加入錐形瓶中,再將3 g KMnO4分多次加入錐形瓶中,在低于20 ℃下反應2 h,升溫至35 ℃反應30 min;向錐形瓶中加入46 mL H2O,升溫至98 ℃,反應20 min,溶液變為棕黃色,再向錐形瓶中加入5 mL H2O2,溶液呈亮黃色,室溫下攪拌30 min,最后用水離心洗滌數次,直至上清液呈中性且不含硫酸根.

1.3 Fpg的檢測

具體的實驗方案如下:將T1鏈(50 nmol/L)加入不同濃度的Fpg在37 ℃下恒溫反應100 min,反應結束后加入氧化石墨烯的水溶液(15 μg/mL),振蕩混勻,室溫下混合10 min,反應總體積為100 μL.將反應后溶液與Tris-HCl緩沖溶液進行混合,轉入石英比色皿中,測量其熒光強度.設置激發波長為494 nm,記錄發射光譜在504～600 nm的數據,將激發和發射的狹縫設置為10 nm.所有熒光實驗均重復3次,并計算誤差棒.具體實驗原理如圖1所示.

圖1 Fpg熒光傳感原理示意圖

1.4 凝膠電泳分析

為驗證實驗原理的可行性,將4 μL 1 μmol/L的T1鏈與不同濃度梯度的Fpg(20、40、60、80、100 U/mL)、5 μL 10× NEBuffer 1、5 μL 1 mg/mL BSA進行混合,37 ℃反應1.5 h,反應總體積為50 μL.反應結束后,取10 μL酶切產物進行15%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,在預先配制的1× TBE緩沖溶液(9 mmol/L Tris-HCl,9 mmol/L H3BO3,1 mmol/L EDTA,pH 8.0)中以及在恒電流36 mA條件下電泳90 min.電泳結束后,采用Amersham Typhoon凝膠成像系統對凝膠進行成像,觀察酶切產物的條帶.

2 結果與討論

2.1 氧化石墨烯形貌表征

(a) 所選區域的SEM圖

圖4 氧化石墨烯的EDS譜圖

圖5 氧化石墨烯的FTIR譜圖

2.2 檢測原理分析

將帶有8-oxoG堿基的單鏈DNA與Fpg進行反應.Fpg能夠特異性識別并切除8-oxoG堿基,從而產生兩條酶切產物鏈,其中一條連接了FAM染料且堿基數目較少.反應結束后加入氧化石墨烯.由于短鏈DNA(5個堿基)對氧化石墨烯的連接能力較弱,攜帶熒光基團的短鏈DNA將被釋放出來,且不能被氧化石墨烯淬滅,從而表現出較強的熒光信號.

為證明上述檢測原理,首先對DNA+GO、DNA+Fpg+GO與空白緩沖溶液進行熒光檢測.各樣品的熒光強度F如圖6所示.其中DNA+GO熒光強度較低,DNA+Fpg+GO熒光強度較高,而空白緩沖溶液基本沒有熒光信號.熒光強度測試結果表明,Fpg可以切除8-oxoG堿基,使得T1鏈斷裂為兩部分,帶有FAM基團的短鏈片段對氧化石墨烯的連接能力較弱,不能將其熒光淬滅.

圖6 不同反應體系的熒光光譜圖

隨后,對酶切產物進行電泳分析,其電泳結果如圖7所示.結果表明隨著Fpg濃度(A(Fpg))的逐漸增大(由20 U/mL增大到100 U/mL),T1鏈(圖中第一行條帶)的濃度逐漸減小,酶切反應后釋放的帶FAM基團短鏈片段(圖中最后一行條帶)濃度逐漸增大.而第一列只含有T1鏈的條帶,均表明Fpg能夠特異性識別并切除8-oxoG堿基,產生帶FAM基團的短鏈片段.電泳結果與熒光檢測結果保持一致,進一步證實了熒光基團通過DNA橋接氧化石墨烯實現Fpg定量檢測的機理.

圖7 不同Fpg濃度下酶切產物的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

2.3 反應條件優化

為達到更好的檢測效果,本文對氧化石墨烯的濃度和酶切反應時間等關鍵因素進行優化.

因為實驗利用了氧化石墨烯高效淬滅FAM熒光基團的能力,所以優化氧化石墨烯的濃度(ρ(GO))至關重要.首先對氧化石墨烯濃度進行優化,將不同濃度(5～30 μg/mL)的氧化石墨烯加入總體積為100 μL的反應體系中,測量混合物的熒光強度.如圖8(a)所示,在氧化石墨烯濃度為5～15 μg/mL內,熒光淬滅效率(F0-F1)/F0隨著氧化石墨烯濃度的增大而增高.當氧化石墨烯濃度為15 μg/mL時,熒光淬滅效率達到0.85以上,隨后基本保持不變,因此在后續實驗中將氧化石墨烯濃度設定為15 μg/mL.

(a) 氧化石墨烯濃度

由于酶切反應直接影響熒光響應,而酶切反應時間為關鍵因素,因此對酶切反應時間進行優化,測量不同酶切反應時間下混合物的相對熒光強度Fr,如圖8(b)所示.結果表明隨著酶切反應時間的增加(20～100 min),樣品的熒光信號逐漸增強.考慮到快速檢測的需求,將酶切反應時間設定為100 min.

2.4 Fpg定量分析

在最佳實驗條件下,對該傳感器的檢測性能進行測試.向體系中加入不同濃度的Fpg,并檢測其熒光強度.如圖9所示,在Fpg濃度為0～20 U/mL時,體系中的熒光強度隨著Fpg濃度的增大而增高.這是由于Fpg的濃度越大,在一定時間內被切割的T1鏈越多,釋放出的T1鏈的3′端攜帶FAM基團的片段就越多.因為短鏈片段對氧化石墨烯的連接能力非常弱,這些片段上的FAM基團就不會被氧化石墨烯所淬滅,只有未被切割的T1鏈能夠被氧化石墨烯所淬滅,所以造成體系的熒光信號逐漸增強.實驗發現當Fpg的加入量在0～0.4 U/mL時,Fpg的濃度與熒光強度呈線性關系(圖9插圖).經擬合后得到的線性回歸方程為y=1 181x+703.4,相關系數R2為0.988,其中y代表熒光強度,x代表Fpg的濃度(U/mL).經計算,該熒光傳感方法的檢出限(LOD)為0.014 U/mL.與已有的Fpg檢測文獻相比(表1),本文構建的傳感器的LOD低于滾環擴增(RCA)和磁性納米探針協同熒光法[18]、DNAzyme循環切割分子信標(MB)級聯放大熒光法[23]、含有8-oxoG:PdC堿基對的雙鏈探針熒光法[24]和精胺釕為探針的電化學發光法[25].

表1 DNA橋連氧化石墨烯基熒光傳感器與其他檢測方法的性能對比

圖9 熒光強度與Fpg濃度的關系

2.5 特異性分析

選用RNase A、UDG、APE 1、RNase Ⅰ來評價該方法對檢測Fpg的特異性,RNase A能催化降解RNA,UDG能水解單鏈或雙鏈上的尿嘧啶,APE 1能夠水解斷裂AP位點,RNase Ⅰ可以去除DNA中的腺嘌呤核糖核苷酸(rA).在體系中加入相同濃度(60 U/mL)的上述各種酶,測量混合體系的相對熒光強度.由圖10可知,僅加入Fpg時,熒光強度顯著增強,其他對照組的熒光信號均較低.這表明僅有Fpg可以識別并切除8-oxoG堿基,由于T1鏈3′端攜帶FAM基團的短鏈片段對氧化石墨烯的連接能力弱,從而使得這些短鏈片段游離在溶液中,造成溶液的熒光信號顯著增強,從而實現Fpg的定量檢測.結果表明,本實驗對Fpg的定量檢測具有良好的選擇性和可靠性.

圖10 不同干擾物質對Fpg檢測的影響

2.6 實際樣品中Fpg檢測

采用加標回收法對稀釋后胎牛血清中Fpg進行檢測,將不同濃度的Fpg加入稀釋的胎牛血清體系中.如表2所列,在線性檢測范圍內Fpg的回收率為93.5%～111%,相對標準偏差為1.7%～2.5%,表明該方法能夠較為可靠地檢測Fpg活性.

表2 稀釋胎牛血清中Fpg活性的檢測

3 結 語

本文基于不同長度單鏈DNA橋連氧化石墨烯能力不同的原理構建了一種快速、簡便的Fpg熒光傳感方法.利用SEM、EDS和FTIR等技術對Hummers法合成的氧化石墨烯進行表征,熒光法和電泳法證明反應機理.隨后對氧化石墨烯的濃度和酶切反應時間進行優化.在最佳反應條件下對Fpg進行定量檢測,該傳感器檢測的線性范圍為0～0.4 U/mL,檢出限為0.014 U/mL,且具有較高靈敏度.采用加標回收法對稀釋后胎牛血清中的Fpg進行檢測,回收率為93.5%～111%,相對標準偏差為1.7%～2.5%.該方法的建立為Fpg的簡便靈敏檢測提供了新方法,為評價DNA氧化損傷、污染物毒性提供了技術支持.