枸杞多糖對梗阻性黃疸小鼠肝功能的保護作用*

朱羽君

南陽醫(yī)學高等專科學校基礎醫(yī)學部,河南省南陽市 473061

梗阻性黃疸(Obstructive jaundice, OJ)是由各種原因引起的以膽汁淤積、肝膽組織受損等一系列病理生理改變?yōu)橹鞯呐R床癥候群[1-2]。枸杞是我國傳統(tǒng)中藥方劑中的常用配方成分,味甘、性平,具有延緩衰老、明目安神、抗疲勞等多種保健功效,其中枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP)是枸杞發(fā)揮功效的主要成分[3]。研究表明,LBP有明顯的肝細胞保護活性,且無毒副作用[4-5],LBP還具有抗氧化活性以及對線粒體的保護作用等[6]。本研究以梗阻性黃疸小鼠為研究對象,通過LBP實施干預,觀察肝功能總膽紅素(TBIL)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)指標及肝組織中TNF-α、NF-κB、IKK-α、IκB-α表達的變化,為梗阻性黃疸患者保肝方案提供新的治療線索,也為枸杞中藥資源的開發(fā)利用提供新的研究方向。現(xiàn)將相關結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 納入成年健康雄性昆明小鼠60只,體質量(20±2)g,實驗小鼠由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要實驗試劑及儀器 枸杞多糖(購于寧夏啟元藥業(yè)),0.9%NaCl,冰醋酸,EDTA,蘇木素,多聚甲醛,松節(jié)油等試劑,TBIL、ALT、AST 試劑盒,DAB 染色液,NF-κB P65,TNF-α一抗,PCR儀,核酸蛋白檢測儀,高速低溫離心機等。

1.3 方法 采用隨機數(shù)字表法將60只小鼠分為3組,即假手術組(Blank control group, B組)、模型組(Model group, M組)和枸杞組(Lycium barbarum polysaccharide group,L組),每組20只。

模型組和枸杞組行膽總管結扎致肝損傷構建梗阻性黃疸模型,采用張守華等[7]構建黃疸模型的方法并加以改良。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,仰臥位固定于手術臺,備皮,消毒鋪巾。在上腹部正中做切口,進入腹腔并提出十二指腸,找到并暴露膽總管,用不可吸收手術絲線將膽總管懸掛于腹壁,依次縫合手術傷口。48h后剪斷膽總管固定線。之后枸杞組于手術后2d行固定時間枸杞多糖500mg/(kg·d)灌胃,連續(xù)給藥6周。假手術組小鼠只進行腹部切開手術,不進行模型構建和枸杞多糖干預即空白對照組。

1.4 觀測指標

1.4.1 標本采集與處理:用消毒后的手術剪行腹腔切口后,分離出肝臟組織,并進行分解,10%甲醇溶液固定后石蠟包埋切片,用于免疫組化分析。

1.4.2 肝功能指標檢測:采用生物化學分析法檢測血清中TBIL、ALT、AST等肝功能指標的濃度,操作方法參照試劑盒說明書。

1.4.3 免疫組織化學染色:采用鏈霉親和素—生物素—過氧化物酶復合物組織化學染色法(Strept Avidin-Biotin Complex, SABC)檢測小鼠肝臟組織中TNF-α的表達,采用Realtime-PCR技術檢測NF-κB、IKK-α、IκB-α的表達水平,操作方法按照試劑盒說明書步驟進行。

2 結果

2.1 一般情況及肉眼觀察 在建模的6周時間內,三組小鼠均未出現(xiàn)由建模或喂養(yǎng)或其他原因導致死亡的情況。建模成功后假手術組小鼠的食欲、生長均正常;隨著梗阻時間的增加,模型組和枸杞組小鼠的活躍度降低,出現(xiàn)嗜睡,尿液顏色逐漸變黃,建模成功約2d后小鼠的皮膚、毛發(fā)、耳尖等部位出現(xiàn)局部發(fā)黃現(xiàn)象;而經(jīng)過一段時間的干預后,枸杞組小鼠的癥狀均輕于模型組小鼠。

2.2 各組肝功能指標比較 模型組小鼠血清TBIL、ALT、AST水平處于三組的最高水平,枸杞組的TBIL、ALT、AST水平較模型組有明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(t=14.863、5.324、5.232,均P<0.001);但枸杞組的TBIL、ALT、AST水平仍然分別高于假手術組,差異均有統(tǒng)計學意義(t=11.341、10.864、30.105,均P<0.001)。見表1。

表1 各組肝功能指標比較

2.3 各組TNF-α、NF-κB、IKK-α、IκB-α指標比較 模型組小鼠肝組織中TNF-α、NF-κB、IKK-α的表達處于三組的最高水平,枸杞組的TNF-α、NF-κB、IKK-α表達水平較模型組有明顯下調,差異均有統(tǒng)計學意義(t=-7.471、-15.583、-22.856,P<0.001);但枸杞組的TNF-α、NF-κB、IKK-α表達水平仍然分別高于假手術組,差異均有統(tǒng)計學意義(t=5.981、6.001、14.381,均P<0.001);而IκB-α的表達水平則呈完全相反的趨勢,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組TNF-α、NF-κB、IKK-α、IκB-α指標比較

3 討論

目前研究認為 OJ的主要發(fā)病機制是由于肝臟的內外膽管因內部壓力原因造成的完全或不完全梗阻,進而引發(fā)肝臟清除內毒素的能力急劇降低[8]。當梗阻長期存在時,可能引起膽管組織的纖維化,進一步加劇膽汁的流動受阻,尤其是患者還合并有膽道感染時,膽管還會出現(xiàn)萎縮、炎性細胞浸潤等并發(fā)癥[9]。梗阻也會使得肝竇的血液流動受阻,進而導致繼發(fā)性的門靜脈高壓,最終導致肝臟損傷[10]。

ALT、AST是肝內主要的功能酶,主要存在于肝細胞內,當出現(xiàn)肝臟細胞膜損傷或肝細胞壞死等情況時,ALT、AST會流入血液中,使血清中的轉氨酶水平升高。TBIL是直接膽紅素和間接膽紅素的總和,當肝臟功能出現(xiàn)發(fā)生障礙時,會引起TBIL在血液中積聚,進而發(fā)生黃疸癥狀。本組研究發(fā)現(xiàn),模型組小鼠血清的TBIL、ALT、AST水平處于三組的最高,而經(jīng)枸杞多糖干預后的小鼠TBIL、ALT、AST水平較模型組有明顯降低,但仍然高于假手術組(空白對照組)。這提示枸杞多糖對梗阻性黃疸肝損傷有明顯的改善和保護作用,同時對減輕肝臟纖維化具有促進作用。劉翔探討黃芪多糖與枸杞多糖聯(lián)用對小鼠肝組織損傷的保護作用也發(fā)現(xiàn),枸杞多糖對四氯化碳(CCl4)所致小鼠急性肝損傷有明顯的保護作用[11]。

近年來關于細胞因子與免疫功能相關關系的研究顯示[12-13],當機體發(fā)生梗阻性黃疸時肝臟內的TNF-α等細胞因子的過量表達,促使炎癥反應的加速,是導致繼發(fā)性肝損傷的重要原因。本研究中,枸杞組的TNF-α、NF-κB、IKK-α表達水平較模型組有明顯下調,但高于假手術組,而IκB-α的表達水平則呈完全相反的趨勢,提示通過6周枸杞多糖灌胃干預后,下調了梗阻性黃疸肝損傷小鼠機體內TNF-α、NF-κB、IKK-α表達水平,上調了IκB-α的表達水平,通過減少與其下游的信號分子的結合,從而控制了小鼠體內的炎癥反應,改善和保護了肝功能的損傷[14]。提示枸杞多糖的干預通過抑制TNF-α所介導的NF-κB信號通路,進而在梗阻性黃疸肝損傷的改善及保護中起到關鍵作用[15]。

綜上所述,枸杞多糖干預對梗阻性黃疸小鼠的肝功能具有保護作用,能有效改善肝損傷小鼠的肝功能和免疫功能,可能通過抑制腫瘤壞死因子α介導的核轉錄因子κB信號通路發(fā)揮作用。