農藥硫丹抗體制備以及酶聯免疫試劑盒的研究

□ 王兆芹 北京勤邦科技股份有限公司

硫丹是一種人工合成的有機氯化合物，廣泛用作農藥殺蟲劑。由于該藥物具有殺蟲范圍廣、價格低廉、對蜜蜂低毒等優點，因此被廣泛應用于防治棉花、果樹、大豆、蔬菜、茶及煙草等各種農作物中的害蟲。我國于20世紀90年代開始生產硫丹，到2011年，登記使用的硫丹產品有47種，涉及藥企43家，稱為該藥物的第二大生產國。該藥物有效期長，但具有生物富集作用，對魚類、貝類等有較大危害性，對哺乳動物具有累積毒性，已有大量文獻報道在蔬菜、水果等農作物中檢測到硫丹殘留。

目前，全球有70多個國家禁止生產和使用硫丹。根據我國農業部等五部委聯合發布的1586號公告，撤銷硫丹在蘋果樹和茶樹中的登記。這就意味著硫丹不得繼續在已撤銷的作物中使用，并將逐步淘汰硫丹的生產和使用。

國內外對于硫丹的研究方法多采用固相萃取與氣相色譜法檢測。與這兩種方法相比，免疫化學檢測法對藥物檢測具有快速、特異、靈敏、準確、可批量檢測、樣品處理簡單、能實現自動化操作等優點。而免疫化學法檢測硫丹的前提是需要具備針對硫丹的抗體，本文研究了硫丹人工抗原制備方法，并將其應用于酶聯免疫試劑盒中，能夠檢測蔬菜、水果中的硫丹殘留量，且具有用時短、操作簡單、成本較低等優點，適用于基層單位大批量檢測樣品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

圖1 硫丹半抗原合成

硫丹標準品（純度≥95%）：北京標準物質研究中心；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）（分析純）、卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）（分析純）：美國Sigma公司；蔬菜、水果：超市。

MK3酶標儀（最大量程為4.0）：購自上海雷勃分析儀器有限公司；MX-F渦旋儀：湖南湘立科學儀器有限公司；HFJ-10均質器：湖南湘立科學儀器有限公司；JA2003電子天平：上海力辰儀器科技有限公司。

1.2 制備抗原

1.2.1 制備半抗原

取硫丹醇3.6 g，加1,4-二氧六環100 mL溶解，充分攪拌，后加入分子篩3.0 g，加琥珀半醛1.02 g，充分攪拌，通入鹽酸氣，避光室溫攪拌5 h；停止反應，加入0.5 mol/L NaOH溶液，200 mL充分震蕩，加乙酸乙酯200 mL，充分震蕩，靜置，分去水相，有機相加水80 mL洗滌，震蕩后靜置，分去水相，有機相無水硫酸鈉干燥蒸干，上硅膠柱，二氯甲烷/甲醇（v/v，10/1）洗脫純化，得到琥珀縮醛硫丹半抗原產物2.1 g，收率45.75%。

1.2.2 制備免疫原

取琥珀縮醛硫丹16 mg，加DMF 1 mL溶解，加NHS 18.7 mg，DDC 33 mg，室溫反應3 h，得到半抗原溶液A液；取牛血清白蛋白（BSA）50 mg，加0.05 M PB緩沖液溶解，得到B液，將A液滴加到B液中，4℃反應12 h，0.02 M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到硫丹-BSA偶聯物，即為免疫原，-20℃保存，備用。

1.2.3 制備包被原

取琥珀縮醛硫丹10 mg，加DMSO 1 mL溶解，加NHS 6.7 mg，EDC 16 mg，室溫反應3 h，得到半抗原溶液A液；取卵血清白蛋白（OVA）50 mg，加0.05M PB緩沖液溶解，得到B液，將A液滴加到B液中，4 ℃反應12 h，0.02 M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到硫丹-OVA偶聯物，即為包被原，-20 ℃保存，備用。

1.3 制備酶標記抗抗體

將“1.2”得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內，產生抗血清，脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合、克隆，得到雜交瘤細胞株，純化后得到硫丹單克隆抗體，進而免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體，將其與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯，最終得到酶標記抗抗體。

1.4 檢測性能

1.4.1 計算檢測限

分別檢測20份黃瓜、蘋果空白樣本，利用空白樣本濃度的平均值加上3倍標準差，計算檢測限（LOD），即檢測方法可檢測出的最低被測物濃度。

1.4.2 精密度和準確度

分別對黃瓜、蘋果樣本添加硫丹，使黃瓜濃度達到50 μg/kg、100 μg/kg和200 μg/kg，使蘋果濃度達到100 μg/kg、200 μg/kg和400 μg/kg，測定添加回收率，以此評價該試劑盒的準確度。同時，每個樣本做4個平行，按照上述“1.4”制備3批酶標板，計算相對標準偏差（RSD%），以此評價該試劑盒的精密度。

1.4.3 測定穩定性

通過測定試劑盒的保存條件，評價該試劑盒的穩定性。將試劑盒保存于4℃，每個月測定一次最大吸光度值（0 μg/L）、IC50以及黃瓜、蘋果樣本的回收率，連續測定12個月。

1.4.4 測定抗體特異性

滴滴涕、水胺硫磷與硫丹同屬于有機氯農藥，結構類似，測定上述藥物的IC50，根據下式計算該試劑盒對于滴滴涕、水胺硫磷的交叉反應率：

2 結果與分析

2.1 計算檢測限

本研究對黃瓜樣本的檢測限為41.4 μg/kg，對蘋果樣本的檢測限為85.1 μg/kg，見表1和表2。

表1 黃瓜的檢測限測定（μg/kg）

表2 蘋果的檢測限測定（μg/kg）

2.2 精密度和準確度

按50 μg/kg、100 μg/kg兩個濃度的硫丹對蔬菜樣品進行添加回收測定，按100 μg/kg、200 μg/kg兩個濃度的硫丹對水果樣品進行添加回收測定，平均回收率分別為81.2%～92.3%，74.8%～87.9%；批內、批間相對標準偏差均小于15%。

2.3 測定穩定性

將試劑盒保存在4℃，測定的試劑盒的最大吸光度值（0μg/L）范圍是1.55～1.83，50%抑制濃度范圍是4.5～7.5 μg/L，硫丹添加回收率范圍是71.8%～96.6%，由此可見，各指標均在正常范圍之內。從測定結果可知，該試劑盒在4℃至少能夠保存12個月。

2.4 測定抗體特異性

硫丹抗體與滴滴涕、水胺硫磷的交叉反應率見表3。由表3可知，硫丹抗體與滴滴涕、水胺硫磷的交叉反應率小于1%。

表3 交叉反應率試驗

3 討論

圖2 勤邦制備的硫丹殘留酶聯免疫試劑盒

本研究制備了抗硫丹單克隆抗體，并研發出相應的ELISA試劑盒，本試劑盒對黃瓜的檢測限為41.4 μg/kg，對蘋果樣本的檢測限為85.1 μg/kg；回收率分別為81.2%～92.3%，74.8%～87.9%；批內、批間相對標準偏差均小于15%。硫丹單克隆抗體的特異性較好，與滴滴涕、水胺硫磷的交叉反應率小于1%。ELISA試劑盒能夠在4℃下保存12個月，主要指標在正常范圍內，可見穩定性較好。勤邦制備的硫丹殘留酶聯免疫試劑盒已投入市場，目前來看產品性能穩定，能夠達到客戶要求，為基層單位大批量地檢測樣品中是否殘留農藥硫丹提供了便捷的快速檢測方法。