江蘇地區水禽源主要細菌病流行情況調查分析

顧陳怡，董洪燕，郭長明，封琦，謝軍，宋海港，吳植

（ 江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300 ）

中國是水禽生產大國，飼養量占世界總量的70%，肉鴨、蛋鴨及肉鵝產業的產值均呈穩定增加態勢[1-2]。但隨著飼養規模化程度不斷提高，飼養密度不斷增大，水禽養殖中許多疫病不斷發生，尤其是細菌感染已成為制約水禽產業快速發展的重要影響因素。大腸桿菌病、沙門氏菌病和鴨疫里氏桿菌病是當前危害水禽養殖業的主要細菌疾病。在商品代水禽場，大腸桿菌、沙門氏菌和鴨疫里氏桿菌感染所導致的病理變化較相似，以“三炎”即心包炎、肝周炎和氣囊炎為主。在種水禽場，大腸桿菌病導致的危害更大，常導致患病禽類關節腫大、產蛋率下降和死淘率上升。有調查指出，細菌感染嚴重會導致水禽發病死亡[3-5]。

江蘇是水禽養殖大省，但水禽疫病的控制形勢不容樂觀。當前對水禽細菌性疾病的流行情況、血清型分型、耐藥基因和毒力基因的攜帶情況等均缺乏系統調查研究，加之部分地區藥物敏感性監測尚不完善，因而造成抗生素藥物的不規范使用，在生產養殖中給水禽細菌病的預防和控制帶來了嚴峻的挑戰。基于此，本研究依托江蘇省現代農業（水禽）產業技術體系，對江蘇全省范圍內水禽源常見細菌病開展流行現狀的調研與分析，以期為江蘇地區水禽細菌性疾病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2021—2022年共采集江蘇省10個地級市64個水禽養殖場的樣品768份，主要包括肛拭子和組織樣品兩種類型。

肛拭子的采集對象為臨床健康水禽，用滅菌的脫脂棉棒插入肛門2～4 cm處，在肛門口內輕輕旋轉涂擦。

組織樣品采集對象為剖檢具有典型腹膜炎、心包炎、肝周炎和氣囊炎等病理變化的水禽，無菌采集肝臟、心臟、肺臟等組織。將棉棒或組織分別放入盛有TSB培養基（需氧增菌培養）和TSB+石蠟培養基（厭氧增菌培養）的指形管中保存，依次編號記錄，帶回實驗室。詳細記錄養殖場的性質、水禽的日齡、免疫程序、發病情況和藥物使用等背景資料。

1.2 主要試劑

50×TAE、細菌DNA模板提取試劑盒購自康為世紀生物科技股份有限公司；瓊脂糖、DL2000 DNA Marker、PCR產物回收試劑盒購自大連寶生物公司；胎牛血清購自Gibico公司；DNA凝膠回收試劑盒購自康寧公司；布氏培養基、肉湯培養基、牛肉浸粉等購自青島海博生物技術有限公司；優質瓊脂糖購自西班牙Bio-west。

1.3 儀器設備

SW-CJ-1F凈化工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）、IS-RDS3搖床（廣州深華生物技術有限公司）、TGL-16B臺式冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）、9902 PCR基因擴增儀（賽默飛世爾科技中國有限公司）、DDY-6C電泳儀（北京六一儀器廠）、Tanon-2500凝膠成像系統（上海天能公司）等。

1.4 PCR引物設計與合成

參考相關文獻[6-8]分別合成大腸桿菌fimA、沙門氏菌stn、鴨疫里氏桿菌OmpA特異性引物用于PCR檢測，引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，引物序列信息具體見表1。

1.5 臨床樣品處理

將無菌采集的肛拭子和組織樣品立即放置于37 ℃、220 r/min的搖床上培養12～24 h。采用煮沸法提取細菌的DNA模板，吸取0.8～1.0 mL菌體培養液于指形管中，12 000 r/min離心3～5 min，棄上清；菌體沉淀重新懸浮于1 mL的ddH2O中，12 000 r/min離心3～5 min，再次棄上清；菌體沉淀重新懸浮于200 μL的ddH2O中，用100 ℃沸水煮沸10 min后，再0 ℃冰浴5 min，之后12 000 r/min離心8～10 min，吸取的上清液即為細菌DNA，轉移至新的指形管中并于-20 ℃保存。

1.6 臨床樣品PCR檢測

以分別提取的DNA為模板，分別按照參考文獻建立的PCR的體系和反應程序，利用設計的引物對大腸桿菌fimA、沙門氏菌stn、鴨疫里氏桿菌OmpA引物進行PCR快速檢測。

PCR擴增體系（共20 μL）：細菌DNA模板2 μL、Primer-F 0.5 μL、Primer-R 0.5 μL、Premix Taq 10 μL、無菌水7 μL。

PCR檢測擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃/55 ℃/58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環；72 ℃下延伸10 min，降溫至4 ℃保存。

取5 μL PCR產物進1.2%瓊脂糖凝膠電泳，以DL2000 為DNA Marker，Goldview染色后，在瓊脂糖凝膠電泳成像系統上觀察其擴增情況，出現與預期目的片段大小的計為陽性，依據陽性樣品數與樣品檢測總數分別計算大腸桿菌fimA、沙門氏菌stn、鴨疫里氏桿菌OmpA等基因的檢出率。

2 結果與分析

2.1 樣品來源（見圖1）

圖1 樣品來源Fig.1 Sample source

由圖1可知，本調查共采集來自江蘇省10個地級市64個水禽養殖場的樣品768份，其中肛拭子樣品510份，組織樣品258份。

2.2 江蘇地區水禽大腸桿菌F1菌毛基因fimA檢出率（見圖2）

圖2 江蘇地區水禽大腸桿菌F1菌毛基因fimA檢出率Fig.2 Detection rate of F1 fimA gene of Escherichia coli in waterfowl in Jiangsu Province

由圖2可知，大腸桿菌F1菌毛基因fimA的平均檢出率為74.21%（570/768），其中肛拭子樣品的平均檢出率為70.58%（360/510），組織樣品的平均檢出率為81.40%（210/258）。泰州地區的肛拭子和組織樣品F1菌毛fimA基因檢出率均為最高，分別為86.05%、86.84%。

2.3 江蘇地區水禽沙門氏菌stn基因檢出率（見圖3）

圖3 江蘇地區水禽沙門氏菌stn基因檢出率Fig.3 Detection rate of stn gene of Salmonella in waterfowl in Jiangsu Province

由圖3可知，沙門氏菌stn基因的平均檢出率為5.60%（43/768），其中肛拭子樣品的平均檢出率為2.75%（14/510），組織樣品的平均檢出率11.24%（29/258）。連云港地區肛拭子和組織樣品中沙門氏菌stn基因檢出率均為最高，分別為5.13%（2/39）、33.33%（6/18）。

2.4 江蘇地區水禽鴨疫里氏桿菌OmpA基因檢出率（見圖4）

圖4 江蘇地區水禽鴨疫里氏桿菌OmpA基因檢出率Fig.4 Detection rate of OmpA gene of Riesiella pestipestii in waterfowl in Jiangsu Province

由圖4可知，鴨疫里氏桿菌OmpA基因平均檢出率為2.73%（21/768），其中肛拭子樣品的平均檢出率為9.52%（2/21），組織樣品的平均檢出率7.36%（19/285）。徐州地區的組織樣品OmpA基因檢出率最高為20.83%；而各地區肛拭子的檢出率均較低，從0～1.64%不等。

3 討論

禽致病性大腸桿菌（avian pathogenicE. coli）是導致水禽感染或繼發感染死亡率最高的一類細菌病，可垂直傳播[6-8]。水禽因感染禽致病性大腸桿菌死亡常見的臨床特征有：大腸桿菌蜂窩織炎、傳染性腹膜炎、敗血癥、心包炎、纖維蛋白性肝周炎、氣囊炎、腸道盲腸炎、骨髓炎、關節炎、腦膜炎、大腸桿菌性肉芽腫、大腸桿菌臍炎等[9-10]。禽致病性大腸桿菌分離株血清型種類呈現多樣化，如郭長明等[11]從國內20個地區的水禽中分離得到24株腸道外致病性大腸桿菌，主要的血清型有O1、O2、O18等。徐亞亞等[12]臨床分離鑒定出120株禽致病性大腸桿菌，主要血清型包括O78、O18、O24和O88等。

鴨疫里氏桿菌（Riemrella anatipestifer）主要感染2～3周齡的雛鴨，以纖維素性心包炎、氣囊炎、肝周炎、腦膜炎和關節炎為主要臨床特征[13-14]。鴨疫里氏桿菌傳染性強、致死率高，目前已成為危害鴨場最重要的傳染病之一[15]。鴨疫里氏桿菌血清型眾多且復雜，國際公認已分離鑒定出21個血清型，且仍有新的血清型不斷被發現。目前不同血清型之間缺乏交叉保護，對鴨疫里氏桿菌的臨床診斷和疫苗防控造成極大的困難[16-17]。

沙門氏菌病又稱副傷寒，是由致病性沙門氏菌感染引起的一類細菌性傳染性疾病。近年來，隨著鴨、鵝養殖數量和養殖規模不斷提高，沙門氏菌病發病率也呈逐年升高趨勢，對水禽養殖業造成的危害和帶來經濟損失也越來越大[18]。由于沙門氏菌的感染途徑多樣化，若養殖管理不當，會造成沙門氏菌在整個養殖領域快速傳播，進而導致群體凈化處理耗時延長。

大腸桿菌、沙門氏菌和鴨疫里氏桿菌感染是危害水禽養殖業的主要細菌病。本試驗在PCR快速檢測的過程中，均選取了參考菌株作為對照，保證了檢測結果的特異性和準確性。大腸桿菌F1菌毛fimA基因的平均檢出率分為74.21%（570/768）；沙門氏菌stn基因平均檢出率為5.60%（43/768）；鴨疫里氏桿菌OmpA基因平均檢出率為2.73%（21/768），表明江蘇地區水禽細菌性疾病中大腸桿菌的檢出率最高。在商品代水禽養殖場，這3種細菌病引起的臨床癥狀和病理變化較相似，需進一步通過細菌的分離鑒定及PCR檢測進行鑒別診斷。在種鴨場、種鵝場，大腸桿菌的發病率更高，通常可引起卵黃性腹膜炎、關節炎和腳蹼炎癥等，這與本試驗中PCR檢測的結果相符。本研究結果，由于水禽養殖規模化程度不斷地提高，大腸桿菌、沙門氏菌及鴨疫里氏桿菌感染無明顯的季節性。

4 結論

近年來，水禽疫病呈現多種病原混合感染或繼發感染的現象，使大腸桿菌、沙門氏菌及鴨疫里氏桿菌感染等細菌病的情況更加復雜。本研究初步分析了江蘇地區水禽源細菌病主要流行情況，可為今后水禽細菌病的綜合防控提供參考。