基于網絡藥理學探討銀黃可溶性粉治療雞沙門氏菌病的作用機制

王婷婷，韋秋旭，張銘林，謝小東，朱浩，趙微微，秦俊杰，胡庭俊*

（ 1.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005 ；2.北京生泰爾科技股份有限公司，北京 102600 ； 3.北京市中獸藥工程技術研究中心，北京 102600 ）

雞沙門氏菌病是由沙門氏菌引起的一種人畜共患病，會導致雛雞腹瀉和全身敗血癥，甚至引起人腹瀉、嘔吐、發(fā)熱[1]。目前，養(yǎng)殖戶主要通過抗生素預防及治療雞沙門氏菌感染，但是抗生素長期使用會使細菌產生耐藥性，導致治療效率降低[2]。諸多研究表明，中草藥及其制劑能夠通過多成分、多途徑、多靶點發(fā)揮抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎的功效，且具有不易產生耐藥性的特點，因而在雞場中的使用頻率逐漸提高。中獸醫(yī)辨證認為，雞沙門氏菌感染后的癥狀以脾虛濕盛為主，脾虛則水濕不運，水濕容易下趨大腸，導致腹瀉，治療時應清熱解毒，化濕調氣，改善腸道溫濕環(huán)境。由金銀花-黃芩配伍研發(fā)而成的銀黃可溶性粉具有清熱解毒、宣肺燥濕功效，可有效改善雞沙門氏菌感染。飼料中添加金銀花對提高雞的生長性能、抗氧化性、免疫指數(shù)等具有很好的促進作用[3]。黃芩富含有黃酮、甾體和生物堿，具有較好的抗炎、抗菌、抗腫瘤的效果[4]。銀黃可溶性粉目前主要用于治療雞大腸桿菌感染，在臨床中初步嘗試發(fā)現(xiàn)，銀黃可溶性粉對治療雞沙門氏菌感染也具有一定效果，但作用機制并不清楚。本文通過網絡藥理學初步探究銀黃可溶性粉治療雞沙門氏菌的作用機制，旨在為進一步建立分子對接網絡預測模型奠定基礎，為銀黃可溶性粉應用于雞病的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 銀黃可溶性粉-有效成分-靶點的網絡圖構建

利用TCMSP（https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索銀黃可溶性粉中金銀花和黃芩的有效成分及靶點，從Uniport數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）下載雞的基因組。利用“VLOOKUP”函數(shù)篩選靶基因，將獲得的藥物成分和靶點導入Cytoscape3.9，繪制銀黃可溶性粉-成分-靶點網絡圖。

1.2 雞沙門氏菌疾病靶點的獲取

以“Salmonella gallinarum”為關鍵詞，通過GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫搜索雞沙門氏菌的疾病靶點。

1.3 PPI蛋白互作網絡構建

通過venny2.1.0在線網站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將獲得的銀黃可溶性粉和雞沙門氏菌的靶點復制粘貼，制作韋恩圖，交集基因為藥物疾病共同靶點。將其導入String數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/），得到銀黃可溶性粉和雞沙門氏菌蛋白互作圖并導出TSV文件，將靶點信息導入Cytoscape3.9進行分析和可視化，利用Excel軟件篩選出degree排名前15的核心靶點。

1.4 Go和KEGG富集分析

將治療靶點粘貼至DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）的分析框，選擇“OFFICIAL-GENESYMBOL”，物種選擇“Gallus gallus”，點擊“gene list”，上傳數(shù)據(jù)后，下載GO和KEGG數(shù)據(jù)。設置P＜0.01，篩選GO和KEGG條目，利用微生信在線平臺進行數(shù)據(jù)可視化分析。

2 結果與分析

2.1 銀黃可溶性粉活性成分篩選和有效成分-靶點的網絡圖構建

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出黃芩含有36種有效成分，507個靶蛋白；金銀花含有23種成分，449個蛋白。Uniport數(shù)據(jù)庫下載已驗證過的雞基因2 211個，利用“VLOOKUP”函數(shù)將TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到的成分和靶蛋白與已驗證過的雞基因進行標準化后得到42種活性成分和61個靶點。將成分和靶點導入Cytoscape3.9構建銀黃可溶性粉有效成分-靶點網絡圖，見圖1。

圖1 銀黃可溶性粉-有效成分-靶點網絡圖Fig.1 Plot of Yinhuang soluble powder - active ingredient - target network

由圖1可知，該網絡包含105個節(jié)點和10 920條邊。根據(jù)degree值篩選出前十的藥物有效成分和靶點，結果見表1和表2。

表1 銀黃可溶性粉-成分-靶點網絡圖中節(jié)點連接度前十的有效成分Tab.1 Top 10 active components in node connectivity of Yinhuang soluble powder-composition-target network diagram

表2 銀黃可溶性粉-成分-靶點網絡圖中節(jié)點連接度前十的靶點Tab.2 Top 10 targets with node connectivity in Yinhuang soluble powdercomposition target network diagram

2.2 銀黃可溶性粉與雞沙門氏菌病的交集靶點（見圖2）

圖2 銀黃可溶性粉與雞沙門氏菌病的交集靶點Fig.2 Intersection target of Yinhuang soluble powder and Salmonella gallinae

由圖2可知，通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫共搜索到雞沙門氏菌病的靶點1 409個。將這些疾病靶點與61個藥物靶點導入venny2.1.0，得到30個共同靶點，為銀黃可溶性粉治療雞沙門氏菌的作用靶點。

2.3 藥物與疾病靶點蛋白相互作用結果

將藥物和疾病共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇“Gallus gallus”，最低要求的互動分數(shù)設置為0.04，構建PPI網絡圖，結果見圖3。將TCSV中的靶點導入Cytoscape 3.9，構建網絡圖對關鍵靶點可視化，結果見圖4。

圖3 銀黃可溶性粉-雞沙門氏菌的PPI網絡圖Fig.3 PPI network diagram of Yinhuang soluble powder - Salmonella gallinae

圖4 銀黃可溶性粉-雞沙門氏菌關鍵點的PPI網絡圖Fig.4 PPI network diagram of key points of Yinhuang soluble powder- Salmonella gallinae

由圖3、圖4可知，白細胞介素-6（IL-6）靶點出現(xiàn)的頻率最高，其次是B細胞淋巴瘤（BCL2L1）靶點，推測其在銀黃可溶性粉治療雞沙門氏菌病中發(fā)揮較重要的作用。

關鍵靶點中degree排名前15的核心靶點見圖5。

圖5 關鍵靶點中degree排名前15的核心靶點Fig.5 Core targets with a degree of top 15 among key targets

由圖5可知，排名前15核心靶點依次是IL-6、BCL2L1、雌激素受體1（ESR1）、缺氧誘導因子（HIF1A）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、NFKB抑制劑α（NFKBIA）、MYC原癌基因（MYC）、白細胞介素-10（IL10）、前列腺素內過氧化物合成酶2（PTGS2）、重組人血紅素氧合酶-1（HMOX1）、干擾素γ（IFN-γ）、重組蛋白（IFNG）、一氧化氮合酶（NOS2）、基質金屬蛋白酶2（MMP2）、聚[ADP-核糖]聚合酶1（PARP1）。

2.4 GO功能和KEGG富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對關鍵靶點進行生物過程（biological process）、細胞組成（cellular component）、分子功能（molecular function）等3個方面的GO富集分析，結果見圖6～圖8。

圖6 銀黃可溶性粉-雞沙門氏菌的GO富集分析（生物過程）Fig.6 GO enrichment analysis of Yinhuang soluble powder- Salmonella gallinae （biological process）

圖7 銀黃可溶性粉-雞沙門氏菌的GO富集分析（細胞組成）Fig.7 GO enrichment analysis of Yinhuang soluble powder- Salmonella gallinae（ cellular component）

圖8 銀黃可溶性粉-雞沙門氏菌的GO富集分析（分子功能）Fig.8 GO enrichment analysis of Yinhuang soluble powder- Salmonella gallinae （molecular function）

由圖6～圖8可知，設置P＜0.01，共得到44個GO通路，其中生物過程、細胞組成、分子功能分別涉及27、7、10個條目。生物過程主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正負調節(jié)、絲氨酸磷酸化調節(jié)及細胞對缺氧的反應、免疫反應、細胞凋亡等方面的研究；細胞成分主要包括細胞核、細胞質、細胞間隙等；分子功能主要涉及蛋白質二聚體活性、RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區(qū)域序列特異性DNA結合和DNA結合、蛋白質結合、蛋白激酶結合。

KEGG富集分析總共得到16條通路，見圖9。

圖9 銀黃可溶性粉-雞沙門氏菌的KEGG富集分析Fig.9 KEGG enrichment analysis of Yinhuang soluble powder- Salmonella gallinae

由圖9可知，KEGG通路主要涉及C-型凝集素受體、細胞凋亡、細胞自噬、細胞衰老、沙門氏菌感染、NOD受體反應、VEGF信號通路、腸道免疫網絡的IgA產生、MAPK信號通路等。綜上所述，銀黃可溶性粉的有效成分可通過細胞核、細胞質、類固醇激素、巨噬細胞活化等多個生物過程參與沙門氏菌感染、腸道免疫網絡的IgA產生、VEGF信號通路、MAPK信號通路等多條信號通路，以達到治療雞沙門氏菌的目的。

3 討論

本研究結果顯示，TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出銀黃可溶性粉含有42個活性成分，61個靶點與雞沙門氏菌相關。槲皮素、木犀草素、山柰酚均屬于黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化的功效，能夠促進動物的生長發(fā)育。黃酮類化合物能夠抑制沙門氏菌的活性，降低血清中白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等炎癥因子的表達，提高腸組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的表達水平[5]。槲皮素具有抗炎止痛、抗病毒、抗菌、抗?jié)兊壬锘钚裕軌蛘{節(jié)腸道免疫，維持腸道菌群平衡，促進腸道吸收[6]。山柰酚是Ca+通道阻斷劑，能夠抑制高K+誘導的持續(xù)回腸收縮，治療回腸痙攣[7]。木犀草素通過核因子κB（NF-κB）信號通路顯著下調LPS致炎IEC-6細胞的IL-6、TNF-α、NF-κB等炎癥因子的表達，抑制組胺的釋放，保護腸黏膜免受損傷[8-9]。黃芩素是黃芩中含量最多的一種活性成分，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤的功效，能夠顯著下調LPS誘導的RAW264.7細胞的一氧化氮（NO）、TNF-α、IL-6水平[10]。雞沙門氏菌感染會引起一系列炎癥反應，銀黃可溶性粉具有良好的抗炎活性，能夠緩解機體炎癥。由此推斷，銀黃可溶性粉可通過抗炎和抗菌活性治療雞沙門氏菌引起的腸炎性腹瀉。

本研究中，PPI網絡圖表明，IL-6、BCL2L1、ESR1、HIF1A、VEGFA、NFKBIA、MYC、IL-10為治療雞沙門氏菌病的關鍵基因。IL-6是機體急性損傷時重要的炎癥因子，是治療雞沙門氏菌感染最核心的靶點，主要通過增強CTL細胞和NK細胞的功能，促進特異性抗體分泌[11]。BCL2L1是一種抗凋亡基因，編碼的蛋白質與線粒體內環(huán)境穩(wěn)定相關，在正常B細胞的增殖和分化過程中發(fā)揮重要作用[12]。ESR1可降低NF-κB的DNA活性，抑制IL-6啟動子的轉錄[13]。HIF1A調節(jié)細胞增殖和代謝[14]。VEGFA與血管內皮上的酪氨酸蛋白激酶受體結合，促進細胞存活、新血管形成和血管舒張[15]。NFKBIA是NF-κB抑制劑，通過掩蓋NF-κB蛋白的核定位信號（NLS）并將其隔離在細胞質中的非活性狀態(tài)抑制NF-κB[16]。此外，NFKBIA也是IL-1β分泌的負調節(jié)因子，能夠減少中性粒細胞的活化，對抗炎和免疫調節(jié)起到積極影響。MYC原癌基因蛋白影響細胞生長、增殖、凋亡、代謝等生物學過程，與炎癥損傷和修復密切相關[17]。IL-10能夠促進組織上皮細胞的先天免疫，抑制炎癥引起的組織損傷，保持其上皮層的完整性[18]。綜上所述，IL-6、BCL2L1、ESR1、HIF1A、VEGFA、NFKBIA、MYC、IL-10等靶點與炎癥有關，表明銀黃可溶性粉可能會通過作用于炎癥相關靶點發(fā)揮治療沙門氏菌的作用。

GO和KEGG富集分析結果顯示，銀黃可溶性粉治療雞沙門氏菌參與了免疫應答、轉錄、凋亡等生物學過程及VEGF、MAPK等多個信號通路。雞群密度過大，空氣流動不暢，飼料發(fā)霉，飲用水污染等因素引起沙門氏菌感染，損傷雞呼吸道和消化道。目前臨床中多采用慶大霉素、氟苯尼考等抗生素治療沙門氏菌感染，但是大多數(shù)雞對廣譜抗生素具有很大的耐藥性，治療效果不顯著[19]。黃芩和桑白皮配伍顯著降低了20%酵母懸液致炎的大鼠血清中PGE2、IL-6和TNF-α炎癥因子水平[20]。缺氧刺激會啟動VEGF的轉錄，增加其表達量。黃芩苷、黃芩素通過IL-6、TNF-α和VEGF通路抑制胰腺炎癌血管的形成[21]。MAPK信號通路主要調節(jié)基因轉錄、蛋白質合成、細胞增殖、遷移、分化、衰老和凋亡，并介導免疫細胞P38的活化，抑制炎性細胞因子產生[22]。因此，VEGF信號通路、MAPK信號通路是銀黃可溶性粉治療雞沙門氏菌的主要通路。

4 結論

本研究結果顯示，銀黃可溶性粉通過槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素等活性成分，作用于IL-6、BCL2L1、ESR1、HIF1A、VEGFA、NFKBIA、MYC、IL-10等關鍵靶點，通過VEGF信號通路、MAPK等信號通路，參與免疫應答、轉錄、細胞凋亡等生物過程，抑制沙門氏菌引起雞的炎癥反應，修復腸道黏膜屏障、降低腸道應激，達到治療雞沙門氏菌的效果。