羔羊糞便中產酸克雷伯菌的分離鑒定及藥敏試驗

李仕林，吐努克·巴合提別克，王德超，巴合提別克·庫爾班，焦海宏

（ 1.特克斯縣畜牧獸醫發展中心，新疆 伊犁 835500 ；2.塔里木大學動物科學學院，新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300 ）

克雷伯氏菌屬（K. lebsiella）目前可分為6種，分別為產酸克雷伯菌（K. oxytoca）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）、植生克雷伯菌（K. planticola）、土生克雷伯菌（K. terrigena）和活動克雷伯菌（K. mobilis）[1]。克雷伯菌在大型奶牛場患臨床乳房炎病例中的分離率為13.0%，僅次于大腸桿菌（14.4%）[2]。其中產酸克雷伯菌具有較強的內毒素釋放能力[3]，為革蘭氏陰性菌，是主要的條件致病菌，存在于人和動物的腸道，可導致人畜患病[4]，引起肝膿腫、腹膜炎、腸炎、腹瀉[5]。

隨著養殖業規模不斷擴大，由產酸克雷伯菌引起動物發病的概率大大增加，給養殖業造成了較大的經濟損失。本研究通過采集腹瀉羔羊糞便，進行細菌分離培養、生化鑒定、16S rRNA基因擴增測序、藥敏試驗、中藥體外抑菌試驗等，旨在為預防治療由克雷伯菌引起的動物疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

樣品為從新疆南疆策勒縣某規模化羊場無菌采集兩周齡內腹瀉羔羊的糞便75份，于實驗室4 ℃冰箱保存。

1.1.2 試驗動物

試驗小鼠均由塔里木大學動物科學學院獸醫系動物實驗站提供。

1.1.3 主要試劑

麥康凱瓊脂（MAC）培養基、伊紅美藍瓊脂（EMB）培養基均購自杭州生物試劑有限公司，LB肉湯瓊脂培養基購自北京奧博星生物技術有限責任公司，腦心浸液瓊脂（BHI）培養基購自碧迪醫療器械（上海）有限公司，5%綿羊血清由塔里木大學動物實驗站提供，革蘭氏染色試劑購自上海源葉生物科技有限公司。

腸道菌科細菌生化鑒定管購自杭州生物試劑有限公司，細菌16S rRNA的PCR擴增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，2×Power Taq PCR MasterMix購自北京百泰克生物技術有限公司，細菌基因DNA提取試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

麥氏比濁管購自常德比克曼生物科技有限公司，藥敏紙片購自杭州生物試劑有限公司，甘草、艾葉購自新疆阿拉爾市郭森中藥房。

1.1.4 主要儀器

BL-75A型立式壓力蒸汽滅菌氣筒（上海東亞壓力容器制造有限公司）、101型電熱鼓風干燥箱（北京市永光明醫療儀器有限公司）、CJ-2DF凈化工作臺（上海康路儀器設備有限公司）、XM4008隔水式恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、E200生物顯微鏡（上海巴拓儀器有限公司）、ZWY-240臺式恒溫搖床（上海智城儀器有限公司）、H-1650-W臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）、DK-80數顯恒溫水浴鍋（常州高德儀器制造有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 分離培養

無菌采集樣品同時接種于MAC培養基、EMB培養基37 ℃恒溫培養18～24 h培養，觀察菌落形態特征，將疑似菌株接種于LB固體培養基37 ℃恒溫培養18～24 h純化培養；挑取單菌落接種于LB液體培養基，37 ℃恒溫培養18～24 h；將菌液進一步接種于綿羊血平板，37 ℃恒溫培養18～24 h，觀察其形態結構。

1.2.2 革蘭染色鏡檢

挑取MAC培養基單個疑似菌落進行革蘭染色鏡檢。

1.2.3 生化試驗

將上述細菌純化物分別接種于生化試驗微量發酵管中37 ℃恒溫培養18～24 h，按照生化管說明書添加不同試劑，根據《常見細菌系統鑒定手冊》判定試驗結果。

1.2.4 16S rRNA基因擴增

根據細菌DNA提取試劑盒說明書，提取菌體DNA，進行16S rRNA基因擴增，目的片段大小1 500 bp左右。引物序列為：1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT；27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。

反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。

PCR產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，將測序結果在NCBI數據庫進行BLAST比對，得到的產酸克雷伯菌進行排序編號。

1.2.5 致病性試驗

將純化的分離株接種于LB液體培養基，37 ℃恒溫培養18～24 h得到菌液。挑選30只體重15～20 g的小鼠，隨機分為6組，每組5只。第1～第5組為試驗組，第6組為對照組。各試驗組小鼠分別腹腔注射5株分離菌株的菌液0.3 mL/只，對照組小鼠腹腔注射無菌生理鹽水0.3 mL/只，正常飼喂12 h，觀察結果。若出現小鼠死亡則進行剖解，無菌采取心、肝，取適量心肝滲出液接種于MAC培養基，37 ℃恒溫培養18～24 h，觀察菌落特征并進一步染色鏡檢。

1.2.6 藥敏試驗

取1.2.5中適量已純化菌液，用生理鹽水稀釋至菌液濃度為1.5×108CFU/mL（0.5麥氏比濁管），無菌棉簽蘸取少量稀釋菌液均勻涂布于BHI瓊脂培養基，將20種藥敏片均勻貼于培養基表面，37 ℃培養18～24 h，觀察結果并測量抑菌圈大小。

1.2.7 中藥體外抑菌試驗

采用水煮法制備藥液，稱取甘草、艾葉各20 g，組成方劑。加入8～10倍純凈水浸泡24 h后，先用大火煎沸，后改用小火煎煮。第1次煎煮30～60 min，過濾藥液；第2次加入5倍純凈水煎煮30 min，過濾藥液；合并兩次濾液，煎煮至藥液終濃度為1 g/mL，3 000 r/min離心取上清，121 ℃高壓滅菌，4 ℃保存。

制備BHI瓊脂培養基，取1.2.5中適量已純化菌液分別均勻涂布于培養基表面，打孔器高溫殺菌，在培養基上打孔，火焰封底。一孔加入40 μL蒸餾水作為對照，其余3孔添加入相同的藥液40 μL，藥液終濃度為1 g/mL。37 ℃恒溫培養18～24 h，觀察結果。使用游標卡尺測量抑菌圈大小，并作記錄；抑菌效果評價方式參考盧宇[6]的研究：抑菌圈直徑（d）≥20 mm為極敏，20 mm＞d≥15 mm為高敏，15 mm＞d≥10 mm為中敏，10 mm＞d＞6 mm為低敏，d≤6 mm為無抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養結果（見圖1～圖3）

圖1 分離株在MAC培養基上的特征Fig.1 Characterization of isolates on MAC medium

從新疆某規模化羊場無菌采集樣本75份，共分離出10株疑似產酸克雷伯菌。疑似菌株在MAC培養基上形成粉紅色黏稠菌落（見圖1）；在EMB培養基上形成較大、黏稠、易融合成一片的粉紅色菌落（見圖2）；綿羊血平板上形成較大、凸起、白色黏液狀的菌落，用接種環蘸取少許菌落可拉成線絲（見圖3），LB液體培養基上生長數日可形成黏稠液體。

圖2 分離株在MBC培養基上的特征Fig.2 Characterization of isolates on MBC medium

圖3 分離株在綿羊血平板培養基上的特征Fig.3 Characterization of isolates on sheep blood plate culture-medium

2.2 分離株革蘭染色鏡檢結果（見圖4）

圖4 分離株革蘭染色鏡檢結果Fig.4 Results of gram staining microscopy of isolates

由圖4可知，分離株革蘭染色鏡檢呈陰性粗短的直桿菌，呈單個、成對或短鏈狀排列。

2.3 生化試驗結果（見表1）

表1 生化試驗結果Tab.1 Identification results of biochemical tests

由表1可知，分離株分解葡萄糖，產酸產氣；利用枸櫞酸鹽；賴氨酸反應陽性；鳥氨酸脫氫酶反應陰性；甲基紅陰性；靛基質反應陽性。理化特性參考《常見細菌系統鑒定手冊》[7]，表明分離菌與產酸克雷伯菌常規生化反應相符。

2.4 16S rRNA基因擴增與測序

10株分離株經擴增得到長度為1 500 bp的條帶，與預期相符，結果見圖5。

圖5 分離株16S rRNA電泳結果Fig.5 Results of 16S rRNA electrophoresis of isolates

將已純化的PCR產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果在NCBI數據庫進行BLAST對照，結果顯示，分離菌與產酸克雷伯菌SHO-1菌株（登錄號：GU361112.1）、產酸克雷伯菌SB3051菌株（登錄號：AJ871863.1）相似度大于98%，表明本研究共鑒定出5株產酸克雷伯菌，編號為1～5號菌株。

2.5 致病性試驗結果（見表2）

表2 致病性試驗結果Tab.2 Pathogenicity test results

由表2可知，第1～第4組小白鼠全部死亡，死亡小鼠無腹瀉現象。第5組小白鼠生長良好，對照組（第6組）小白鼠生長良好。結果表明，所分離的5株產酸克雷伯菌中1～4號菌株具有致病性。

死亡小白鼠解剖無菌采集肺、肝接種于MAC培養基，37 ℃恒溫培養18～24 h，挑取菌落染色鏡檢呈短鏈或成對球形，與上述鏡檢形態一致。

2.6 藥敏試驗結果（見表3）

表3 藥敏試驗結果Tab.3 Results of drug sensitivity test

由表3可知，產酸克雷伯菌對米諾環素、多西環素、四環素、慶大霉素、頭孢哌酮、丁胺卡那、頭孢曲松、呋喃唑酮、復方新諾明、氯霉素、環丙沙星、氧氟沙星高度敏感，對多黏菌素B中度敏感，對紅霉素、新霉素、卡那霉素、克林霉素、諾氟沙星、麥迪霉素、萬古霉素低度敏感或耐藥。

2.7 中藥體外抑菌試驗結果（見表4）

表4 中藥體外抑菌試驗結果Tab.4 Antibacterial test results of traditional Chinese medicine in vitro 單位：mm

由表4可知，甘草、艾葉組成的方劑對5株產酸克雷伯菌均產生了抑菌效果，且對不同菌株抑菌效果有所不同。

3 討論

產酸克雷伯菌屬于條件致病菌，曾經從植物及水生環境中檢出，也存在于人和動物腸道內，可導致人畜患病。本試驗從腹瀉羔羊糞便中分離出10株具有產酸克雷伯菌特征的細菌，經PCR測序得到5株產酸克雷伯菌，之后進一步進行了藥敏試驗及中藥體外抑菌試驗。藥敏試驗結果表明，試驗分離的產酸克雷伯菌對米諾環素、多西環素、四環素、慶大霉素、頭孢哌酮、丁胺卡那、頭孢曲松、呋喃唑酮、復方新諾明、氯霉素、環丙沙星、氧氟沙星高度敏感，對多黏菌素B中度敏感，對萬古霉素等藥物低度敏感或耐藥，這與曾家瓊等[9]研究的結果一致，可能是研究中的產酸克雷伯菌均分離自動物糞便。李月等[10]研究表明，產酸克雷伯菌對頭孢曲松、慶大霉素、四環素、氯霉素、復方新諾明、氧氟沙星、環丙沙星耐藥，與本試驗結果差異顯著。出現這種差異的原因可能是：李月等[10]研究中的豬場病原混合感染嚴重，大量不合理使用抗生素，導致抗生素耐藥性增強以及豬場疾病復雜多樣；病原未明確，導致無法合理篩選抗菌藥；且李月等[10]研究中的菌株為豬源性，而本研究所分離菌株來自羔羊，具有一定種屬差異。

目前抗生素價格相對低廉、使用方便，但生產過程中由于抗生素濫用導致細菌對抗生素產生了耐藥性[11]，已經成為動物疫病防控治療中的難題，動物疫病防控面臨巨大挑戰。中草藥作為中國傳統藥材，來源廣泛，資源豐富，毒副作用低，使用方便，同時具有抗菌、抗病毒、免疫調節、提高生產性能的功效[12]。本試驗根據綿羊采食草料特性，選用綿羊可采食中草藥（甘草、艾葉）進行體外抑菌試驗。本試驗結果表明，由甘草和艾葉組成的方劑對試驗分離的5株產酸克雷伯菌產生了抑菌作用。艾葉抑菌成分為揮發油、黃酮，甘草的主要抑菌成分包括甘草黃酮、甘草查爾酮、甘草酸等，這與張召興等[13]研究中甘草素、甘草查爾酮A為甘草中主要抑菌成分的結果相符。王華等[14]研究表明，艾葉水提液對葡萄球菌、大腸桿菌等菌均具有抑制作用。甘草酸能夠抑制變形鏈球菌生長、產酸、黏附及生物膜形成[15]，艾葉的有效成分艾葉揮發油對大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌均具有抑菌作用[16]。上述文獻也證實了甘草和艾葉具有一定的抑菌效果。

4 結論

本試驗從南疆規模化羊場共采集腹瀉羔羊糞便75份，經細菌分類培養、PCR鑒定共得到5株產酸克雷伯菌，且具有一定的致病性。藥敏試驗結果表明，產酸克雷伯菌對米諾環素、多西環素、四環素、慶大霉素、頭孢哌酮、丁胺卡那、頭孢曲松、呋喃唑酮、復方新諾明、氯霉素、環丙沙星、氧氟沙星高度敏感，對多黏菌素B中度敏感，對紅霉素、新霉素、卡那霉素、克林霉素、諾氟沙星、麥迪霉素、萬古霉素低度敏感或耐藥。中藥體外抑菌試驗結果表明，甘草、艾葉組成的方劑對本研究分離的產酸克雷伯菌產生了一定抑菌效果。