低溫脅迫下漯麥163的生理生化變化及抗寒基因表達分析

曹燕燕,葛昌斌,廖平安,崔江寬,黃 杰,郭春強,王 君,盧雯瑩

(1.漯河市農業科學院,河南漯河 462300; 2.河南農業大學植物保護學院,河南鄭州 450002)

目前全球氣候逐漸變暖,促使小麥幼穗分化進程加快,拔節期提前,進而導致春季低溫(倒春寒)來臨時小麥更易受到凍害。同時隨著倒春寒天氣發生頻率和強度增加,也嚴重影響了小麥的產量和品質。因此,倒春寒已成為限制小麥高產的主要氣象災害之一。

黃淮麥區作為中國小麥主產區之一,每年小麥播種面積和產量約占全國小麥播種總面積和產量的58%和67%[1]。目前倒春寒已成為該地區重要的農業氣象災害之一,主要發生在春季3月下旬至4月上中旬,此時小麥正處于拔節至開花期,幼穗分化正處于雌雄蕊分化期至四分體時期,處于低溫敏感期[2],連續3 d以上的低溫就會對小麥造成巨大的傷害。2004-2005年黃淮麥區發生了大規模的倒春寒,其中僅河南省的受災面積就超過1.33×106hm2,絕收面積高達2.67×105hm2左右[3];2009年再次遭遇倒春寒,使該地區小麥大面積減產,損失嚴重[4];2012-2013年,黃淮麥區遭受60年一遇的特重倒春寒,僅3月下旬到4月下旬就發生了10次,受災面積達總播種面積的41.8%[1]。倒春寒的頻繁發生、不規律性和不可控性,加上災前預防不及時,災后補救措施難實施,都會對小麥產量造成巨大的損失[5],因此倒春寒已成為黃淮麥區小麥生產中急需解決的關鍵問題。開展倒春寒對小麥品種生長發育及其產量形成的影響研究,為提高小麥抗寒性提供理論和技術支撐,并對保障黃淮麥區小麥的高產、穩產具有重要的理論和實踐意義。

小麥抗寒性是由多個因素共同作用的的結果,是一個復雜的生物性狀[6]。研究表明,小麥的抗寒性與葉綠素含量、抗氧化酶活性、丙二醛含量、可溶性蛋白含量[1,7-11]等密切相關。小麥在受到低溫脅迫時,體內會發生一系列適應低溫的生理生化變化,這也是植物抗寒能力最基本的反映,同時低溫會誘導小麥體內抗寒相關基因的表達。小麥抗寒性是由多個微效基因控制,目前,在小麥苗期低溫馴化過程中已分離鑒定出超過450個抗寒基因,但春季低溫下的表達情況研究較少[12]。

為深入研究小麥響應倒春寒的生理生化及抗寒基因的表達情況,本研究選取在田間春季拔節期抗寒性表現較好的小麥品種漯麥163及其母本漯麥6010為研究對象,于拔節期在人工智能低溫室進行低溫脅迫,分析低溫脅迫對小麥體內葉綠素、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及抗寒相關基因(SOD、WCS120、LEA和P5CS)表達量的影響,以期為小麥品種抗寒性評價方法的建立以及抗寒性遺傳改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥材料為國審品種漯麥163及其母本漯麥6010,均為弱春性品種,由漯河市農業科學院提供。

1.2 試驗方法

試驗于2020-2021年在漯河市農業科學院試驗基地采用盆栽法進行。用內徑30 cm、高60 cm的無底花盆,花盆底部用網袋扎緊,表面與地表持平?；ㄅ鑳雀鶕筇?～20 cm、20～40 cm、40～60 cm土層分層填土壓實,澆透水沉實土壤后于10月18日播種,每個品種種植12盆,其中9盆用于低溫脅迫處理,用于取樣;其余3盆進行常溫處理,作為對照,共計24盆。于3葉期進行定苗,每盆留苗10株。根據土壤墑情決定澆水量,每盆澆水量一致。

1.2.1 低溫脅迫處理

于拔節期,將18盆小麥(每個品種9盆)移入人工智能低溫室進行低溫(-5 ℃)脅迫處理,分別于低溫處理1 d、2 d和3 d時取主莖最上部展開葉,用于生理生化指標測定和抗寒基因表達分析。每個品種取3盆,3次重復,以常溫處理為對照。

1.2.2 生理生化指標的測定

葉綠素、脯氨酸含量以及SOD活性的測定均利用酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒說明書進行。

1.2.3 抗寒基因的表達模式分析

用RNA提取試劑盒提取小麥葉片總RNA,用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,大連)將總RNA反轉錄為cDNA第一鏈。用Primer Premier 5.0設計引物,由上海派森諾基因科技有限公司合成(表1)。以小麥Actin為內參基因,以cDNA為模板,在CFX96 Real Time PCR Detection System(Bio-Rad,美國) 上進行qRT-PCR,分析抗寒相關基因(SOD、WCS120、LEA和P5CS)的表達模式。PCR反應體系為20 μL,包括2×SYBR real-time PCR premixture 10 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1) 各0.4 μL,模板cDNA 1 μL,RNase free dd H2O補足至20 μL。PCR反應程序:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,40個循環;熔解曲線:95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,95 ℃變性15 s。每個樣品3個生物學重復。采用2-ΔΔCT法計算目標基因的相對表達量。

表1 qRT-PCR分析所用的引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.3 數據處理

利用WPS Office進行數據統計和作圖,用DPS 15.10的Duncan’s新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對小麥葉片葉綠素含量的影響

從表2可以看出,隨著低溫處理時間的延長,漯麥163和漯麥6010的葉綠素含量總體上均呈下降趨勢。低溫處理1～2 d后兩個品種的葉綠素含量與對照均無顯著差異,處理3 d后與對照均差異顯著。低溫處理0～3 d后漯麥163的葉綠素含量均明顯高于漯麥6010。說明低溫脅迫嚴重阻礙了葉綠素的合成,但在兩個品種中的表現略有不同。

表2 低溫脅迫下兩個品種葉片的葉綠素含量、SOD活性和脯氨酸含量的變化Table 2 Changes of chlorophyll content, SOD activity and proline content in leaves ofthe two varieties under low temperature stress

2.2 低溫脅迫對小麥葉片SOD活性的影響

從表2可以看出,隨著低溫處理時間的延長,漯麥163和漯麥6010的SOD活性均呈先升后降的變化趨勢。處理2 d后兩個品種的SOD活性達到最高,均顯著高于對照,但與處理1 d后的SOD活性無顯著差異;處理3 d后兩品種的SOD活性最低,與對照均無顯著差異。對照和低溫處理3 d后漯麥163的SOD活性均明顯高于漯麥6010;而低溫處理1～2 d后漯麥163的SOD活性均明顯低于漯麥6010。說明在低溫處理初期,漯麥6010和漯麥163通過提高葉片中的SOD活性,清除活性氧自由基,維持細胞膜系統的穩定性;隨著低溫處理時間的延長,SOD活性下降,植株表現出對低溫逆境的適應性,但在兩個品種中的表現略有不同。

2.3 低溫脅迫對小麥葉片脯氨酸含量的影響

從表2可以看出,隨著低溫處理時間的延長,漯麥163和漯麥6010的脯氨酸含量均呈先升后降的變化趨勢。低溫處理后兩個品種的脯氨酸含量均顯著高于對照,說明兩個品種均可通過提高脯氨酸含量來適應低溫逆境。處理1 d后兩個品種的脯氨酸含量達到最高,且均顯著高于對照及其他低溫處理;低溫處理2 d后與低溫處理3 d后漯麥163的脯氨酸含量差異顯著,而漯麥6010的脯氨酸含量在兩個時間點無顯著差異。兩個品種間的脯氨酸含量在低溫處理1 d后無明顯差異,而在對照中漯麥163的脯氨酸含量明顯高于漯麥6010,在低溫處理2～3 d后漯麥163的脯氨酸含量明顯低于漯麥6010。

2.4 低溫脅迫對小麥葉片抗寒相關基因表達量的影響

從表3可以看出,隨著低溫脅迫處理時間的延長,漯麥163和漯麥6010葉片中SOD基因的表達量均表現為“降-升-降”的變化趨勢。低溫處理1～3 d后,兩個品種葉片中SOD基因的表達量均顯著低于對照。除對照外,低溫處理下漯麥163葉片中SOD基因的表達量均低于漯麥6010。

表3 低溫脅迫下小麥葉片抗逆相關基因的相對表達量Table 2 Relative expression levels of cold tolerance related genes in wheat leaves under low temperature treatments

隨著低溫處理時間的延長,漯麥163和漯麥6010葉片中WCS120基因的表達量均表現為先降后升的變化趨勢。低溫處理1～3 d后,兩個品種葉片中WCS120基因的表達量均顯著低于對照。除低溫處理1 d后外的其他時間點,漯麥163葉片中WCS120基因的表達量均低于漯麥6010。

隨著低溫處理時間的延長,漯麥163葉片中LEA基因的表達量表現為“升-降-升”的變化趨勢,于處理1 d 后達到最大值,顯著高于其他低溫處理和對照;而漯麥6010表現為“降-升-降”的變化趨勢,對照為最大值,顯著高于其他低溫處理。對照和低溫處理2 d后漯麥163葉片中LEA基因的表達量均低于漯麥6010,低溫處理1 d和3 d后則相反。

隨著低溫處理時間的延長,漯麥163和漯麥6010葉片中P5CS基因的表達量均表現為先降后升的變化趨勢。對于漯麥163,低溫處理1～2 d后P5CS基因的表達量顯著低于對照,低溫處理3 d后則顯著高于對照;對于漯麥6010,低溫處理1 d后P5CS基因的表達量顯著低于對照,低溫處理2～3 d后則顯著高于對照,并于低溫處理3 d后達到最大值。對照和低溫處理3 d后漯麥163葉片中P5CS基因的表達量均高于漯麥6010,低溫處理2 d后則相反,低溫處理1 d后兩個品種葉片中P5CS基因的表達量一致。

3 討論與結論

葉綠素在光合作用中具有重要作用。王瑞霞等[9]研究發現,在拔節期對小麥進行低溫處理,小麥葉片的葉綠素含量顯著下降,但下降的幅度因品種而異。細胞膜的流動性和穩定性是細胞乃至整個植物賴以生存的基礎,滲透調節物質在低溫脅迫下可有效維持細胞結構和功能,對光合作用等生理過程具有積極的作用。張 磊等[13]研究發現,拔節期低溫脅迫下,抗寒性較好的小麥會產生更多的脯氨酸;余海波[7]研究發現,一定程度的低溫脅迫能夠誘導小麥葉片中游離脯氨酸含量的增加,使小麥在短時間內表現出對低溫環境的適應性,但當溫度繼續降低時,脯氨酸含量會下降。低溫脅迫下,植物體內的SOD會清除過多的活性氧自由基,維持細胞膜系統的穩定性,提高植株的抗寒性。張 軍等[14]研究發現,拔節期持續低溫脅迫下,小麥葉片中的SOD活性均有不同程度的增高;薛亞光等[15]則研究發現,稻秸全量還田方式下小麥葉片中的SOD活性隨著低溫脅迫的加重呈下降趨勢,植株表現出對低溫逆境的適應性。

本研究發現,拔節期低溫脅迫阻礙了漯麥163和漯麥6010的葉綠素合成,進一步降低了小麥葉片的光合能力,低溫脅迫時間越長,對小麥葉片的光合作用影響越顯著;低溫脅迫下,兩個品種的SOD活性和脯氨酸含量均顯著上升,有利于減輕小麥膜脂過氧化傷害,維持細胞結構和功能,增強兩個品種的抗寒性,隨著低溫脅迫時間的延長,兩個品種的SOD活性和脯氨酸含量呈下降趨勢,表現出對低溫逆境的適應性。結合兩個品種在田間的抗寒性表現,與生理指標檢測結果相符,說明低溫脅迫下漯麥163和漯麥6010均具有較強的自我保護機制,抗寒性較好。

植物抗寒性是由多基因控制的數量性狀,抗寒相關基因只有在特定條件下才能表達。根據抗寒基因產物的功能可分為功能基因和調控基因兩大類[16]。功能基因直接參與抵抗脅迫反應,主要有滲透調節分子基因P5CS、胚胎發育晚期豐富蛋白基因LEA、抗氧化酶基因SOD以及抗性蛋白基因WCS120等;調控基因主要是通過調控抗寒基因的表達來提高抗寒性,主要包含各種蛋白激酶基因、轉錄因子基因等。WCS120為冷誘導基因,只受低溫脅迫的特異誘導,過表達WCS120可減輕凍害帶來的機械損傷,維持代謝物質的運轉,從而提高植物的抗寒性[17]。SOD作為功能基因,在消除活性氧的過程中具有重要作用,SOD活性的增加有利于減輕小麥在低溫脅迫下造成的膜脂過氧化傷害。P5CS是脯氨酸合成途徑中一個關鍵基因,催化脯氨酸生物合成的最初前兩步,其表達與脯氨酸含量密切相關[18];LEA受逆境脅迫誘導,是一種逆境脅迫響應基因,在植物抵抗逆境中發揮著重要作用[19]。

本研究發現,低溫脅迫下,與對照相比,漯麥163和漯麥6010兩個品種葉片中SOD基因的表達量均顯著下調,與SOD活性表現不一致,原因可能與SOD同工酶有關;在低溫處理2 d和3 d后,漯麥163和漯麥6010兩個品種葉片中SOD基因的表達量與SOD活性測定結果一致。在低溫處理3 d后,兩個品種葉片中P5CS基因的表達量顯著高于對照,與其脯氨酸含量表現相一致。持續低溫處理下,兩個品種葉片中WCS120基因的表達量表現出先降后升的變化趨勢,且顯著高于對照。漯麥163葉片中LEA基因的表達量在低溫處理1 d后顯著上調表達,而低溫處理后漯麥6010葉片中LEA基因的表達量呈顯著下調表達,推測不同品種對低溫的響應機制不同。綜上所述,兩個品種的抗寒性差異主要集中在相關基因的表達,漯麥163主要通過調控LEA和P5CS基因的表達來提高對低溫脅迫的抵抗能力;而漯麥6010則是通過調控P5CS和WCS120基因的表達抵御低溫逆境。

小麥的抗寒性機理復雜,不同基因型小麥品種因發育特點不同,在遭受倒春寒時其受害程度也不同,選育耐寒品種是提高小麥抗倒春寒能力的根本途徑。本研究從生理生化和抗寒基因表達兩方面對漯麥163和漯麥6010的抗寒性進行了分析,并結合大田觀察,發現漯麥163和漯麥6010均具有較強的耐倒春寒能力,可作為抗寒性親本種質資源,加快耐倒春寒小麥品種的選育。