戊糖乳植物桿菌PY1-6發酵豆乳特性及風味品質的研究

趙雅冉,李婭馨,趙強,邢少華,孫雪梅,李華敏,2,3*,劉文麗,2,3*

(1.魯東大學 食品工程學院,山東 煙臺 264025;2.魯東大學 煙臺市預制食品納米科學與技術重點實驗室,山東 煙臺 264025;3.魯東大學 食品綠色加工與質量控制煙臺市工程研究中心,山東 煙臺 264025)

大豆富含蛋白質、酮類及不飽和脂肪酸等營養物質,是肉類和乳制品的主要植物蛋白替代品,且其不含乳糖,可作為包含乳糖不耐受癥患者在內的群體獲取優質蛋白的來源[1-2]。傳統的大豆制品主要以豆腐、豆乳、豆粉和豆豉等為主,大部分豆制品中含有較多的醛類物質,其產生的豆腥味影響了豆制品的感官品質,是制約豆制品產業發展的主要原因。

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)因能改善食品的感官品質及豐富食品的營養等被廣泛應用于食品發酵[2]。豆乳的營養物質含量豐富,可作為乳酸菌發酵的優良載體[3]。乳酸菌發酵能夠有效降低豆腥味,賦予豆乳良好的香氣,改善豆乳的感官品質。豆乳發酵過程中產生的苷元、活性酚類物質、維生素和多肽對抑制腫瘤細胞生長、預防肥胖和骨質疏松也有重要作用[4]。此外,乳酸菌能夠降解豆乳中的抗營養因子,將大分子化合物分解為可被人體吸收利用的小分子化合物,并產生新的營養物質[5]。利用乳酸菌制備酸豆乳,迎合了當今發酵行業以植物基發酵為創新發展“著力點”的趨勢[6]。

菌種是影響發酵食品風味品質的重要因素。Peng等[5]、Zheng等[7]、Wang等[8]分別利用混合乳酸菌、干酪乳桿菌M1以及植物乳桿菌Y16發酵豆乳,發酵后醛類物質減少,醇類、酮類、酸類、酯類等物質增加,有效地改善了豆乳的香氣品質,同時營養特性和抗氧化能力顯著提高。另有研究表明,利用植物乳桿菌X7021發酵豆乳可以降低豆乳的黏性,同時植物乳桿菌對豆腥味化合物的降解效率大于酸奶發酵劑[3]。戊糖乳植物桿菌是植物基發酵的常用菌種,其發酵性能穩定[9],發酵過程溫和[10],植物源材料的利用率高[11],但目前利用戊糖乳植物桿菌發酵豆乳的研究較少。

本文旨在研究戊糖乳植物桿菌PY1-6發酵豆乳的特性,分析酸豆乳的理化指標與風味物質的組成,解析酸豆乳的關鍵風味物質。采用多種差異物質分析方法,確定酸豆乳區別于豆乳的關鍵差異風味物質,為酸豆乳風味的生成和調控提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆、綿白糖:均購于煙臺當地超市;戊糖乳植物桿菌(Lactiplantibacilluspentosus)PY1-6(分離于泡菜):本實驗室保藏;蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏和瓊脂(均為生物試劑):北京奧博星生物技術有限公司;檸檬酸氫二銨、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸氫二鉀、碳酸鈣、乙酸鈉、碳酸鈉、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉和氯化鈉(均為分析純):國藥集團化學試劑有限公司;牛血清白蛋白:上海洛神生物技術有限公司;正構烷烴(C7～C30)、2-甲基-3-庚酮(色譜純):美國Sigma公司;乙腈(色譜純):德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

立式高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;AB33PH-F pH計 奧豪斯儀器(上海)有限公司;恒溫培養振蕩器 天津歐諾儀器股份有限公司;721G可見分光光度計 上海精科實業有限公司;A-45-24-11九陽破壁機 九陽股份有限公司;H1650-W離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;CT-3 質構儀 美國Brookfield公司;57330-U型固相微萃取手柄、57328-U型固相微萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS,StableFlex) 美國Supelco公司;DB-WAX型熔融石英毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm) 安捷倫科技(中國)有限公司;GC/MS-QP2020NX單四極桿型氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 酸豆乳制備

參照Zheng等[7]制備酸豆乳的方法并稍作修改。選用顆粒飽滿的干黃豆,清洗干凈,加入9倍干黃豆重量的水,25 ℃恒溫浸泡12 h,浸泡后的黃豆與水一起加入破壁機中打漿45 min,制備的豆漿在121 ℃滅菌15 min,冷卻至室溫后的豆漿加入6%的綿白糖攪拌均勻。

1.3.2 酸豆乳發酵

將戊糖乳植物桿菌PY1-6接種于MRS液體培養基中,37 ℃培養24 h,4 ℃、4 000 r/min離心5 min,收集菌體,用生理鹽水洗滌菌體2次,離心去除上清液,加入無菌水補充至原體積。按6%接種至豆漿中,37 ℃靜置發酵6 h獲得酸豆乳。

1.3.3 乳酸菌總數測定

每間隔1 h取樣,梯度稀釋,涂布于MRS平板,37 ℃培養48 h,結果以lg CFU/g表示。

1.3.4 pH值測定

取10 mL酸豆乳攪拌均勻,使用pH計測定樣品的pH值。

1.3.5 總酸測定

參照Zhang等[12]的方法,取20 g酸豆乳樣品,用0.1 mol/L的NaOH滴定樣品至pH為8.2±0.2,記錄NaOH用量,測定數值以g/kg表示。

1.3.6 蛋白質濃度測定

取1 g酸豆乳,梯度稀釋。采用福林酚試劑法,以250 μg/mL的牛血清白蛋白繪制標準曲線,測定酸豆乳樣品在660 nm處的吸光度,計算酸豆乳中的蛋白質含量。

1.3.7 質構測定

質構參數測定:TA-4圓柱形探頭直徑為50 mm,測試速度為1.0 mm/s,穿透距離為15 mm,表面觸發力為5 g[13]。利用Exponent軟件計算硬度(N)和黏附力(N)。

1.3.8 持水率測定

參照Bian等[14]的方法并稍作修改,取5 g樣品,4 ℃、8 500 r/min離心20 min,去除上清液,計算酸豆乳的持水率。持水率計算公式如下:

式中:WHC(water holding capacity)為持水率;W0為空離心管的重量(g);W1為樣品與離心管離心前的重量(g);W2為樣品與離心管離心后的重量(g)。

1.3.9 揮發性風味物質檢測

對戊糖乳植物桿菌PY1-6發酵后的酸豆乳(PY1-6組)和未發酵的豆乳(CK組)進行揮發性風味物質分析,參照Peng等[5]的方法并稍加修改。

萃取條件:將5 g樣品和3 μL 2-甲基-3-庚酮(0.01 mg/mL)內標溶液加入到15 mL頂空瓶中。45 ℃、300 r/min攪拌孵育25 min,插入萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)萃取40 min。

GC條件:配置有DB-WAX熔融石英毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)的GC-MS系統;以高純度氦氣(1.0 mL/min)為載氣。40 ℃保持3 min,然后以5 ℃/min升至200 ℃,再以10 ℃/min升至230 ℃,保持10 min,進樣口溫度250 ℃,不分流進樣。

MS條件:全掃描范圍內的電子碰撞電離能為70 eV,離子源溫度為200 ℃,發射電流為200 μA,檢測電壓為350 kV,質譜掃描范圍為55～550 u。

GC-MS檢測結果通過標準物質質譜數據庫(NIST 17)檢索處理,統計匹配度大于80%的揮發性成分,同時根據相同色譜條件下C7～C30正構烷烴的保留時間計算檢測物質的保留指數(retention index, RI),并與質譜庫以及文獻資料中的RI值進行比對,對揮發性化合物進行定性。揮發性化合物含量采用內標半定量法,根據化合物與內標物峰面積的比值進行計算[12],定量公式如下:

式中:Ci為樣品中待測物質的質量濃度(μg/kg);Cs為2-甲基-3-庚酮濃度(μg/kg);Ai為樣品中待測物質對應的色譜峰面積;As為內標物色譜峰面積。

香氣活性值(OAV)是揮發性化合物的濃度與其氣味閾值(odor threshold, OT)的比率[15],揮發性化合物的OAV>1被認為是主要香氣化合物,其OAV越大,對香氣的貢獻越大。

式中:Ci為待測樣品中揮發性化合物濃度(μg/kg);OTi是該物質在水中的風味閾值(μg/kg)。

1.3.10 感官評定

PY1-6發酵前后的豆乳根據定量描述性分析(quantitative descriptive analysis,QDA)要求進行感官評定,感官評定小組由7名女性和6名男性組成,從色澤、豆腥味、酸味、香味、黏稠度5個方面按照1～9由弱到強對發酵豆乳進行評分。

1.3.11 數據處理

2 結果與分析

2.1 發酵特性及理化指標

由圖1可知,發酵6 h后,酸豆乳的乳酸菌菌數和總酸分別上升至(9.11±0.02) log CFU/g和(7.53±0.02) g/kg,pH下降至5.12±0.01,蛋白質含量下降至0.608 mg/g,表明戊糖乳植物桿菌PY1-6在酸豆乳中表現出良好的發酵性能;酸豆乳的總酸與pH的變化主要是由發酵產生的乳酸等有機酸導致的,提高總酸的同時能豐富酸豆乳的風味[5]?？偹崤c活菌數在發酵4 h后趨于穩定,結合pH、總酸以及活菌數的變化進行分析,可能是總酸的升高對戊糖乳植物桿菌的生長起到了抑制作用[16]。

圖1 酸豆乳發酵過程中乳酸菌菌數及理化指標變化

2.2 質構與持水率

硬度、黏附力和持水率是影響酸豆乳理化性質和品質的重要因素。戊糖乳植物桿菌PY1-6對酸豆乳質構特性和持水率的影響見圖2。

圖2 酸豆乳的持水率和質構變化

由圖2可知,發酵前期,酸豆乳的硬度、黏附力、持水率都呈現上升趨勢。酸豆乳的硬度和黏附力主要取決于酸豆乳的pH,pH在4.5～5.5之間會引起大豆蛋白變性,導致酸豆乳的硬度和黏附力上升。持水率主要反映了酸豆乳對水的結合能力,發酵后期,酸豆乳的持水率呈現先下降后上升的趨勢, 硬度呈現下降的趨勢,與孟岳成等[17]的實驗結果相似。酸豆乳開始出現乳清析出,推測酸豆乳中的乳清析出是導致其質構下降的原因。戊糖乳植物桿菌PY1-6在發酵時產生的胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)能夠有效提高酸豆乳的質構和持水率[18]。因此,后期可以通過優化酸豆乳中糖的含量,提高胞外多糖的產量以提高酸豆乳的品質[19]。

2.3 揮發性風味物質分析

由表1可知,未發酵豆乳(CK組)和戊糖乳植物桿菌PY1-6發酵的酸豆乳(PY1-6組)中共鑒定出24種揮發性風味化合物,包括10種醇類、8種醛類、3種酮類、2種酸類以及1種呋喃類。由圖3中A可知,CK組與PY1-6組共有13種相同的揮發性風味物質,醇類和醛類物質是主要的差異物質。發酵后的酸豆乳中醇類物質占比從47.88%上升至71.76%,醛類物質占比從38.60%降低至20.55%,酸類物質占比上升至6.42%,酮類物質發酵前后占比變化較小,醇類與醛類物質的顯著變化是影響酸豆乳風味的主要原因。醇類和酸類物質在發酵后明顯增多,醛類和呋喃類物質被降解,含量明顯降低,另外,酯類和酮類物質顯著增加,發酵前后風味物質的變化表明戊糖乳植物桿菌PY1-6可以有效提高酸豆乳的香氣質量。

A

為了更好地分析戊糖乳植物桿菌PY1-6對酸豆乳風味的影響,采用熱圖對風味物質的組成進行聚類比較。由圖4可知,CK組與PY1-6組醛類與醇類物質差異顯著,豆乳在發酵前,腥味物質如壬醛、正戊基呋喃和2-乙基己醇含量較高,這些腥味物質主要是大豆在被破壞后,其中的亞麻酸、亞油酸在脂氧合酶以及氧氣的作用下催化生成,它們一般為6～9個碳原子的醛類或醇類物質[27-28],特別是壬醛,具有較重的青草味和柑橘皮味,是豆乳的主要腥味物質[29]。發酵后的酸豆乳中未檢測到壬醛、正戊基呋喃和2-乙基己醇,說明戊糖乳植物桿菌發酵可以有效降低豆乳的腥味,提高其風味品質[30]。

圖4 酸豆乳風味物質熱圖

2.3.1 醇類物質

在CK組與PY1-6組中分別檢測出8種和9種醇類物質(見表1)。醇類物質不僅可以由葡萄糖或氨基酸分解代謝生成,而且可以通過脫氫酶還原醛或其他物質得到,PY1-6組苯甲醇(OAV=1 471.41)、正庚醇(OAV=591.57)、正己醇(OAV=33.37)、辛醇(OAV=23.74)和苯乙醇(OAV=2.46)的OAV都大于1,對酸豆乳的香氣有較大影響,是酸豆乳的關鍵風味物質[31-32],主要呈現果香和堅果香。其中,具有柑橘香和果香的辛醇主要由辛醛和壬醛在脫氫酶的作用下還原得到,發酵后含量顯著增加,減少了壬醛的青草味,有效降低了酸豆乳的豆腥味,增加了柑橘香以及果香味[32-33]。

2.3.2 醛類物質

大多數醛類是氨基酸分解代謝、酮酸脫羧或不飽和脂肪酸分解的初級產物[20]。醛類物質是發酵中代謝較快的物質,它們會迅速還原成醇類物質或者氧化為酸類物質,經發酵后醛類物質的改變可以顯著改善酸豆乳的風味[16]。醛類物質的閾值較低,對風味的貢獻較大,CK組與PY1-6組中分別檢測出5種和7種醛類物質(見表1),CK組中對風味影響較大的是癸醛(OAV=10 211.08)、反式-2,4-癸二烯醛(OAV=2 762.01)和壬醛(OAV=1 254.33);PY1-6組對風味影響較大的是反式-2,4-癸二烯醛(OAV=14 754.62)、癸醛(OAV=13 896.97)、反式-2-壬烯醛(OAV=4 734.86)、反式-2,4-庚二烯醛(OAV=1 714.37)和反式-2-辛烯醛(OAV=446.74)。經戊糖乳植物桿菌PY1-6發酵后反式-2-壬烯醛(黃瓜味)、反式-2,4-庚二烯醛(堅果香)和反式-2-辛烯醛(果香、香甜味)顯著上升,這3種醛類物質是酸豆乳中果香味的主要風味物質,能夠賦予酸豆乳更豐富的香味;反式-2,4-癸二烯醛(油脂味)經發酵后顯著增加,使得豆乳呈現淡淡的油脂香味。豆腥味是影響豆乳類產品接受度的主要因素之一,壬醛、2-正戊基呋喃和順式-2-辛烯-1-醇都具有“青草味”,也稱為“草味”和“氧化油味”,是豆腥味的來源[34]。壬醛的青草味是CK組中腥味的主要來源,主要由油酸氧化而來[22]。壬醛在脫氫酶的作用下還原成辛醇,是酸豆乳豆腥味降低的關鍵因素[29]。癸醛(肥皂味、油脂味)的存在增加了酸豆乳中的脂肪和肥皂氣味,癸醛可能是由氨基酸的降解反應、脂質的氧化和降解產生的[35]。

2.3.3 酮類物質

由表1可知,CK組與PY1-6組分別檢測出2種和3種酮類物質,酮類物質多數是由游離脂肪酸氧化和氨基酸降解產生的[16],大多具有怡人的香氣[22]。具有甜味的2-庚酮是酸豆乳中的典型香氣化合物,主要來源于亞油酸的生物轉化[7,36],經過戊糖乳植物桿菌PY1-6的發酵后含量上升;通過發酵產生帶有香味與蘑菇味的3-辛酮,雖然OAV<1,但它對掩蓋醛類物質的豆腥味也具有一定的作用;具有蘑菇味的6-甲基-5-庚烯-2-酮發酵前后變化不顯著。

2.3.4 酸類物質

有機酸的生成對豆乳的發酵有著重要影響,不僅可以酸化大豆蛋白提高酸豆乳的黏度,而且可以提供獨特的香氣。酸類物質主要來源于脂肪的分解[37],經戊糖乳植物桿菌PY1-6發酵后的酸豆乳中檢測出己酸和辛酸兩種酸類物質,己酸本身具有干酪香味和酸味,可為酸豆乳提供特殊的奶酪味。兩種酸類物質在發酵后顯著增加,但是由于閾值較高,不能為酸豆乳的風味作出較大貢獻。

2.3.5 呋喃類物質

呋喃類化合物通常由焦糖化反應和碳水化合物降解產生。CK組2-正戊基呋喃(OAV=179.83)是一種由大豆亞油酸產生的芳香化合物[3],具有明顯的青草味和豆腥味,是豆乳中主要的腥味物質。研究發現,乳酸菌發酵會導致2-正戊基呋喃含量下降,減少了酸豆乳中的豆腥味,對改善豆乳的風味具有極為重要的作用[38]。前期研究表明,豆乳經過植物乳桿菌X7021發酵后,2-正戊基呋喃含量由40.2%下降至13.5%,證明植物乳桿菌能夠顯著降低酸豆乳中的2-正戊基呋喃含量[3]。本研究中的戊糖乳植物桿菌PY1-6發酵豆乳后未檢測出2-正戊基呋喃,表明戊糖乳植物桿菌對2-正戊基呋喃有著更強的降解作用,能夠更好地改善酸豆乳的豆腥味。

2.4 關鍵差異風味物質分析

對CK組與PY1-6組進行PLS-DA分析,結果見圖5。

圖5 偏最小二乘法判別分析評分圖

兩組的揮發性風味化合物各自呈良好的聚類,有較好的重復性和數據可靠性。兩組樣品中揮發性風味化合物沿PC1(76.1%)和PC2(7.52%)嚴格區分,累計方差貢獻率高達83.62%。

為進一步分析CK組與PY1-6組風味物質的差異,使用偏最小二乘回歸分析(PLS-DA)對CK組與PY1-6組的關鍵風味物質進行分析,篩選可變影響投影(variable influence projection,VIP)大于1的物質作為差異風味物質。由圖6可知,有15種VIP值大于1的物質被篩選為豆乳與酸豆乳中的差異物質。差異風味物質中的2-庚酮(甜味)、正庚醇(堅果香)、苯乙醇(花香)、正己醇(果香、紅酒香)、辛醇(柑橘香、果香)、反式-2-辛烯醛(果香、香甜味)、苯甲醇(花香、果香)和反式-2,4-庚二烯醛(堅果香)8種物質的OAV均大于1,是酸豆乳區別于豆乳的關鍵差異風味物質。

圖6 揮發性風味化合物可變影響投影(VIP)得分圖

圖7直觀地表示了風味物質濃度的變化,虛線上方為戊糖乳植物桿菌PY1-6發酵后新生成或消失的物質,虛線下方為濃度變化超過2倍的風味物質。豆乳經發酵后新生成了3-辛酮、反式-2,4-庚二烯醛、反式-2-壬烯醛等8種風味物質,賦予酸豆乳芳香、黃瓜味、果香、堅果香等風味。帶有豆腥味的2-正戊基呋喃、2-乙基己醇、壬醛3種物質在發酵后消失,減輕了酸豆乳的豆腥味。戊糖乳植物桿菌PY1-6發酵后有9種物質含量上升,4種物質含量下降,其中苯甲醇、辛醇、苯乙醇、正己醇、反式-2,4-癸二烯醛和1-戊醇6種物質發酵后含量增加超過2倍,賦予酸豆乳甜香、花香、柑橘香、果香、油脂香等風味。

圖7 揮發性風味物質變化差異圖

為了更好地確定酸豆乳區別于豆乳的關鍵差異標記物,對OAV>1、可變影響投影(VIP)>1和濃度差異大于2倍的物質(FC>2,或FC<0.5,或新生成,或消失)進行綜合分析比較,篩選CK組與PY1-6組中的關鍵差異標記物。由圖8可知,有7種揮發性風味化合物是戊糖乳植物桿菌PY1-6發酵后酸豆乳區別于豆乳的主要差異香氣化合物,分別是反式-2,4-庚二烯醛(油脂味、堅果香)、反式-2-辛烯醛(果香、香甜味)、苯甲醇(甜香、花香、果香)、正庚醇(堅果香)、正己醇(果香)、辛醇(柑橘香)和苯乙醇(花香)。另外,在酸豆乳中新生成的反式-2-壬烯醛的VIP=0.99,雖然VIP值小于1,但是發酵后該物質的OAV=4 734.86,推測反式-2-壬烯醛也是酸豆乳區別于豆乳的關鍵差異風味物質。8種揮發性風味化合物共同的特點是以果香為主要香氣,賦予了酸豆乳較濃厚的香甜氣味。

2.5 感官評定

由圖9可知,豆乳經戊糖乳植物桿菌PY1-6發酵后色澤變化較小,均呈現乳白色;發酵后的酸豆乳豆腥味顯著改善,主要與具有青草味的壬醛和2-正戊基呋喃含量降低有關;香味的改善主要與反式-2-壬烯醛、反式-2,4-庚二烯醛、反式-2-辛烯醛、苯甲醇、正庚醇等具有果香味的風味化合物有關;酸豆乳的黏稠度可能與戊糖乳植物桿菌PY1-6發酵生成的胞外多糖有關。酸豆乳感官整體優于未發酵的豆乳,表明戊糖乳植物桿菌PY1-6可用于豆乳發酵。

圖9 QDA法分析酸豆乳的感官特性

3 結論

本文利用從泡菜中分離的戊糖乳植物桿菌PY1-6發酵豆乳,對酸豆乳進行發酵特性、理化指標及風味物質分析。經戊糖乳植物桿菌PY1-6發酵后的豆乳pH降至5.12,同時表現出較好的硬度與黏度。通過風味物質分析可知,反式-2,4-癸二烯醛(OAV=14 754.62)、癸醛(OAV=13 896.97)、反式-2-壬烯醛(OAV=4 734.86)、反式-2,4-庚二烯醛(OAV=1 714.37)、反式-2-辛烯醛(OAV=446.74)等對酸豆乳的風味貢獻較大,是酸豆乳中的關鍵風味物質,主要賦予酸豆乳油脂香、黃瓜味、堅果香、果香和香甜味等風味。綜合分析OAV、VIP以及風味物質濃度變化等,推測反式-2-壬烯醛、反式-2,4-庚二烯醛、反式-2-辛烯醛、苯甲醇、正庚醇、正己醇、辛醇和苯乙醇8種物質是酸豆乳區別于豆乳的關鍵差異風味標記物。壬醛(豆腥味、青草味、柑橘味)和2-正戊基呋喃(豆腥味、青草味)的香氣活性值較大,是豆乳中豆腥味的主要來源,經戊糖乳植物桿菌PY1-6發酵后消失,明顯改善酸豆乳的豆腥味。綜上來看,戊糖乳植物桿菌PY1-6可以改善酸豆乳的風味,可作為豆乳發酵的優良菌株。