亞硝酸鹽對酸菜中菌屬微生物量的影響及相關(guān)性分析

魏振勇,李娜,孫全敏,王嚴(yán),遲乃玉,張慶芳*

(1.大連大學(xué) 生命健康學(xué)院,遼寧 大連 116622;2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心,遼寧 大連 116622)

自古民以食為天,酸菜發(fā)酵在中國已經(jīng)有3 000多年的歷史,從周朝開始就已經(jīng)有了相關(guān)記載[1]。東北酸菜顏色金黃、味道酸香,含有有機酸和可溶性蛋白等大量的營養(yǎng)物質(zhì),具有抗氧化、抗炎、抗肥胖、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等多種功能,其發(fā)酵菌種主要是乳酸菌,包括植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、腸膜明串珠菌屬(Leuconostocmesenteroides)等[2-3]。亞硝酸鹽(NIT)是常見的致癌物質(zhì)之一,相比于其他食物,在腌制肉制品、泡菜及變質(zhì)的蔬菜中含量較高[4]。有研究表明,正常成人食用0.2～0.5 g的NIT就可以導(dǎo)致中毒現(xiàn)象,如果超過3 g就會危及生命甚至導(dǎo)致死亡,NIT中毒引起的危害主要包括頭痛頭暈、惡心、腹痛、口唇皮膚黏膜紫紺,嚴(yán)重的還會引起高鐵血紅蛋白癥、肺水腫、心源性休克等[5-6]。

在發(fā)酵過程中酸菜勻漿理化指標(biāo)及微生物量和種類對酸菜中揮發(fā)性成分、風(fēng)味等尤為重要。Lin等[7]研究發(fā)現(xiàn),Bacteroides、Lactobacillus、Lactococcus、Enterobacter等菌屬是產(chǎn)揮發(fā)性成分的主要物種。Liang等[8]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和戊酸桿菌共接種發(fā)酵可提高酸菜中醇類、酯類、醛類、烴類和腈類的濃度。目前學(xué)者們專注于發(fā)酵體系中菌群結(jié)構(gòu)以及多樣性的研究,利用相對豐度值變化來分析菌群的生長狀況,但采用相對豐度的分析方法忽略了微生物群落的數(shù)量和屬水平的樣本間差異,造成了分析結(jié)果的偏差[9]。Ruben等[10]研究發(fā)現(xiàn),相對豐度的增加不一定與菌群的生長(絕對豐度的增加)有關(guān),在發(fā)酵過程中可能會出現(xiàn)相對豐度減少,但絕對豐度不變甚至增大的情況。相關(guān)性分析將兩個或多個具備相關(guān)性的變量元素進(jìn)行分析,衡量兩個變量因素的相關(guān)密切程度。遲雪梅等[11]對酸菜中pH、NO2-殘留量、亞硝峰值等指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,研究發(fā)現(xiàn)勻漿最低pH值與菜中NIT殘留量相關(guān)性顯著。韓宏嬌等[12]研究發(fā)現(xiàn)酸菜pH與乳酸菌數(shù)、TAN呈極顯著負(fù)相關(guān)。乳酸菌會降解NIT,但NIT對乳酸菌等菌群的影響、酸菜中優(yōu)勢菌屬微生物量與理化指標(biāo)的相關(guān)性研究鮮有報道。

本研究以白菜為原料,采用小型獨立發(fā)酵體系進(jìn)行發(fā)酵,制作多個獨立體系,每次取樣采用不同的體系,減少雜菌污染的問題,搖勻后取樣,避免了傳統(tǒng)上在發(fā)酵液上、中、下三層取樣的方式。測量發(fā)酵過程中理化指標(biāo)及OD600 nm的變化,將不同發(fā)酵階段菌屬相對豐度與發(fā)酵過程中測定的OD600 nm的乘積作為微生物量,對菌屬微生物量與OD600 nm及理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。探究東北酸菜不同發(fā)酵階段NIT對菌屬微生物量的影響,分析優(yōu)勢菌屬微生物量與OD600 nm及理化指標(biāo)的相關(guān)性,可對未來改善發(fā)酵過程、新型發(fā)酵菌劑的研發(fā)提供參考性意見。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

新鮮大白菜;硼砂、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氫氧化鈉、酚酞、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂(均為分析純):上海麥克林生化科技有限公司;DP812土壤基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒:天根生化科技(北京)有限公司;16S rDNA基因V3～V4區(qū)引物合成及建庫測序:由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3E型pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;CRY-2112恒溫?fù)u床 上海茸研儀器有限公司;DK-S26電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;Thermo Multiskan 1510酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-1200型紫外可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 東北酸菜自然發(fā)酵的制作工藝

1.3.1.1 工藝流程

選取新鮮大白菜→預(yù)處理(修整、清洗、燙漂、瀝水、切分)→裝瓶腌制→注鹽水→封蓋→25 ℃發(fā)酵→獲得成品。

1.3.1.2 操作要點

采用生漬法腌漬東北酸菜。挑選新鮮的大白菜清理好外層葉片,將白菜順著菜幫掰成若干片后,用清水清洗干凈,瀝干表面水分后將白菜切成0.5～1 cm的均勻細(xì)絲。注意保證不同部位的白菜細(xì)絲混勻,選用統(tǒng)一規(guī)格的555 mL PET為材料制備的東北酸菜發(fā)酵容器若干瓶,每瓶分裝160 g混勻的白菜絲,再注入1.5%的鹽水至滿瓶,最終形成封閉發(fā)酵體系,將全部酸菜放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵,得到酸菜成品。

1.3.2 取樣

將自然發(fā)酵酸菜記為S組,添加NIT(亞硝酸鈉100 mg/L)為Y組。每瓶酸菜代表不同發(fā)酵時間點的獨立發(fā)酵體系,酸菜勻漿作為研究對象,以1 h為取樣起點,每隔12 h取出一瓶發(fā)酵菜進(jìn)行理化指標(biāo)(pH、TAN、NIT)及OD600 nm的測定,至發(fā)酵結(jié)束。

1.3.3 酸菜理化指標(biāo)的測定及計算

將瓶內(nèi)酸菜與發(fā)酵液倒入燒杯中,將其全部研磨后制成勻漿,分別稱取10 g酸菜勻漿作為待測樣品,進(jìn)行理化指標(biāo)的檢測[13-14]。pH的測定:使用pH計;TAN含量的測定:參照GB 12456-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法;NIT含量的測定:參照GB 5009.33-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺法;OD600 nm的測定:采用紫外分光光度計測定在波長600 nm處的吸光度值。菌屬的微生物量=所代表菌屬的相對豐度×OD600 nm。以上所有實驗重復(fù)測定3次取平均值。

1.3.4 高通量測序

對S組和Y組的理化指標(biāo)及OD600 nm進(jìn)行分析,選取1 h、13 h、25 h、73 h、15 d 5個時間點的酸菜樣本,S組分別標(biāo)記為 S1、S2、S3、S4、S5;Y組分別標(biāo)記為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5;每個酸菜樣本3個重復(fù)。最后將選出的樣本進(jìn)行16S rDNA高通量測序,按照土壤基因組DNA提取試劑盒說明書提取樣本DNA,以其為模板,采用引物對338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進(jìn)行PCR擴增。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸菜自然發(fā)酵體系OD600 nm、理化指標(biāo)及相關(guān)性分析

2.1.1 自然發(fā)酵體系OD600 nm及理化指標(biāo)

自然發(fā)酵(S組)過程中不同時間點酸菜樣本的OD600 nm及理化指標(biāo)的變化情況見圖1。

圖1 S組發(fā)酵過程中理化指標(biāo)及OD600 nm

由圖1可知,pH值整體呈下降趨勢,在發(fā)酵前期乳酸菌含量較少,產(chǎn)酸量低,pH下降緩慢,在13～25 h下降趨勢劇烈,然后逐漸平緩。馬歡歡等[15]研究表明,pH隨發(fā)酵時間的延長而下降,最終穩(wěn)定在3左右,與本研究結(jié)果一致?？偹?TAN)、OD600 nm呈上升趨勢,Hu等[16]研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵過程中TAN增長是由于乳酸菌產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì),發(fā)酵時間為25 h時,達(dá)到亞硝峰,此時NIT含量為32.63 mg/L,此后NIT含量逐漸降低。

2.1.2 自然發(fā)酵體系OD600 nm及理化指標(biāo)相關(guān)性分析

由表1可知,在1～73 h,S組的OD600 nm與TAN表現(xiàn)為正相關(guān),pH與OD600 nm、TAN均表現(xiàn)為負(fù)相關(guān),NIT與各理化指標(biāo)及OD600 nm相關(guān)性較弱,其原因可能是前期既有NIT生成,又有NIT降解,進(jìn)一步分析達(dá)到亞硝峰(25 h)后理化指標(biāo)及OD600 nm相關(guān)性。

表1 S組在1～73 h理化指標(biāo)及OD600 nm相關(guān)性分析

由表2可知,在25～73 h,S組的pH與NIT、OD600 nm與TAN均表現(xiàn)為正相關(guān),NIT與OD600 nm、NIT與TAN、pH與TAN均表現(xiàn)為負(fù)相關(guān),進(jìn)一步添加亞硝酸鹽驗證整個發(fā)酵過程中理化指標(biāo)及OD600 nm相關(guān)性。

表2 S組在25～73 h理化指標(biāo)及OD600 nm相關(guān)性分析

2.2 酸菜添加亞硝酸鹽體系OD600 nm、理化指標(biāo)及相關(guān)性分析

2.2.1 添加亞硝酸鹽體系OD600 nm及理化指標(biāo)

添加亞硝酸鹽(Y組)發(fā)酵過程中不同時間點酸菜勻漿樣本的OD600 nm及理化指標(biāo)的變化情況見圖2。

圖2 Y組發(fā)酵過程中理化指標(biāo)及OD600 nm

由圖2可知,NIT影響整個發(fā)酵過程中的菌群濃度,使TAN含量整體偏低,其原因可能是一些不耐鹽的產(chǎn)酸菌生長受到抑制,導(dǎo)致pH值整體偏高,在13～37 h,NIT含量下降趨勢更劇烈。

2.2.2 添加亞硝酸鹽體系OD600 nm及理化指標(biāo)相關(guān)性分析

由表3可知,在1～73 h,Y組的OD600 nm與TAN、pH與NIT均表現(xiàn)為正相關(guān),pH與OD600 nm、pH與TAN及NIT與OD600 nm、NIT與TAN均表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。

表3 Y組在1～73 h理化指標(biāo)及OD600 nm相關(guān)性分析

2.3 酸菜發(fā)酵過程中菌屬微生物量與OD600 nm及理化指標(biāo)相關(guān)性分析

2.3.1 酸菜發(fā)酵過程中菌屬微生物量

利用OD600 nm來測量菌群在發(fā)酵階段菌體濃度作為該點樣本中微生物的相對總數(shù),并與高通量測得的各菌屬的相對豐度相乘得出更準(zhǔn)確的各菌屬的相對數(shù)量,因此各菌屬的微生物量(積累量)為所代表菌屬的相對豐度與OD600 nm的乘積。選取菌群中相對豐度前九的優(yōu)勢菌屬進(jìn)行微生物量分析(見圖3),在S組中,Lactococcus、Leuconostoc在發(fā)酵過程中相對豐度變化均呈先上升后下降的趨勢,但其微生物量始終保持上升趨勢。Lactobacillus的相對豐度在S5階段是S3階段的2倍,但其微生物量在S5階段是S3階段的7倍。在Y組中,Lactococcus、Leuconostoc的相對豐度在Y3～Y4階段變化差值分別為2.07%、0.04%,但Lactococcus的微生物量在Y4階段是Y3階段的2.46倍,Leuconostoc的微生物量在Y4階段是Y3階段的2.38倍;Lactobacillus在各發(fā)酵階段相對豐度、微生物量都微小且無明顯變化。因此可知添加NIT對Lactococcus、Leuconostoc的生長有促進(jìn)作用,但對Lactobacillus的生長有抑制作用。在發(fā)酵過程中出現(xiàn)的有害菌屬如uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae,其微生物量Y組始終低于S組,說明NIT可以抑制某些有害菌的生長。

a

2.3.2 酸菜勻漿中菌屬微生物量與OD600 nm及理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

選取1 h、13 h、25 h、73 h、15 d時間點優(yōu)勢菌屬微生物量與OD600 nm及理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果見表4。

由表4可知,在S組中OD600 nm與Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc、Lactobacillus相關(guān)性系數(shù)分別為rs22=0.884 5,rs24=0.929 3,rs25=0.930 8,rs27=0.896 9,相關(guān)性大小順序是|rs25|>|rs24|>|rs27|>|rs22|;TAN與Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相關(guān)性系數(shù)分別為rs32=0.931 1,rs34=0.962 8,rs35=0.964 9,相關(guān)性大小順序是|rs35|>|rs34|>|rs32|;pH與Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相關(guān)性系數(shù)分別為rs42=-0.954 7,rs44=-0.962 7,rs45=-0.952 1,相關(guān)性大小順序是|rs44|>|rs42|>|rs45|。各菌屬微生物量與NIT相關(guān)性較弱,可能是25 h的亞硝峰導(dǎo)致的,進(jìn)一步在Y組中進(jìn)行分析。

由表5可知,在Y組中OD600 nm與Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相關(guān)性系數(shù)分別為ry22=0.968 2,ry24=0.930 2,ry25=0.960 6,相關(guān)性大小順序是|ry22|>|ry25|>|ry24|;TAN與Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相關(guān)性系數(shù)分別為ry32=0.931 7,ry34=0.879 1,ry35=0.985 4,相關(guān)性大小順序是|ry35|>|ry32|>|ry34|;pH與Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相關(guān)性系數(shù)分別為ry42=-0.968 6,ry44=-0.903 3,ry45=-0.921 1,相關(guān)性大小順序是|ry42|>|ry45|>|ry44|;NIT與Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相關(guān)性系數(shù)分別為ry52=-0.952 7,ry54=-0.911 4,ry55=-0.968 5,相關(guān)性大小順序是|ry55|>|ry52|>|ry54|,在Y組中乳酸菌具有較強的降解亞硝酸能力,進(jìn)一步分析乳酸菌微生物量之和與OD600 nm及理化指標(biāo)的相關(guān)性。

表5 Y組各菌屬微生物量與理化指標(biāo)及OD600 nm的相關(guān)性分析

由表6可知,3種乳酸菌微生物量之和與OD600 nm、TAN相關(guān)性系數(shù)分別為rs乳22=0.991 5,rs乳32=0.966 9,相關(guān)性大小順序是|rs乳22|>|rs乳32|。2種乳酸菌微生物量之和與OD600 nm、TAN、pH相關(guān)性系數(shù)分別rs乳23=0.897 3,rs乳33=0.940 9,rs乳43=-0.955 7,相關(guān)性大小順序是|rs乳43|>|rs乳33|>|rs乳23|。

表6 S組乳酸菌微生物量與OD600 nm及理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

由表7可知,3種乳酸菌微生物量之和與OD600 nm、TAN、pH、NIT相關(guān)性系數(shù)分別為ry乳22=0.993 2,ry乳32=0.976 0,ry乳42=-0.980 3,ry乳52=-0.985 0,相關(guān)性大小順序是|ry乳22|>|ry乳52|>|ry乳42|>|ry乳32|;2種乳酸菌微生物量之和與OD600 nm、TAN、pH、NIT相關(guān)性系數(shù)分別為ry乳23=0.993 2,ry乳33=0.975 8,ry乳43=-0.980 4,ry乳53=-0.984 9,相關(guān)性大小順序是|ry乳23|>|ry乳53|>|ry乳43|>|ry乳33|。

表7 Y組乳酸菌微生物量與OD600 nm及理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

東北酸菜具有酸鮮純正、脆嫩芳香、清爽可口、增進(jìn)食欲等特點,微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性是形成其口感的原因,目前學(xué)者為研究菌屬結(jié)構(gòu)對發(fā)酵蔬菜理化指標(biāo)的影響,選取不同發(fā)酵時間點的發(fā)酵蔬菜進(jìn)行研究[17-19]。本研究將本實驗室前期研究成果[20],結(jié)合本次實驗25 h為S組亞硝峰、15 d為最終發(fā)酵時間,因此選取1 h、13 h、25 h、73 h、15 d的酸菜勻漿作為研究對象,分析OD600 nm、理化指標(biāo)及菌群結(jié)構(gòu)的變化。15 d發(fā)酵結(jié)束時(見表8),S組中NIT含量為3.09 mg/L,Y組中NIT含量為11.80 mg/L,低于國家的限量標(biāo)準(zhǔn)。在菌屬結(jié)構(gòu)上,uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Lactobacillus、Lactococcus和Leuconostoc是優(yōu)勢菌屬,其結(jié)果與Rao等[21]的研究結(jié)果相似,乳酸菌是發(fā)酵過程中的關(guān)鍵菌屬,它可以產(chǎn)生有機酸,降低pH[22]。與S組相比較,Y組中TAN減少、pH值增高,該現(xiàn)象與張慶芳等[23]在亞硝酸鹽對Lactobacillusbrevis4903發(fā)酵中的研究結(jié)果相一致。Y組發(fā)酵體系內(nèi)產(chǎn)酸量較低,推測原因可能為乳酸菌產(chǎn)生亞硝酸還原酶將NIT還原為氨氣,氨氣與乳酸菌所產(chǎn)乳酸反應(yīng),導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境中pH值偏高,TAN含量偏少,有利于發(fā)酵早期乳球菌屬的生長與積累。

16S rDNA測序技術(shù)檢測到的相對豐度變化不能準(zhǔn)確地反映微生物量的動態(tài)變化,因不同樣本的微生物總量不同,高通量測序與分光光度計將活菌、死菌同時測量,所以將相對豐度與OD600 nm相結(jié)合,分析發(fā)酵過程中微生物量的變化。研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵過程中相對豐度減少,不能說明其微生物量一定減少,甚至有可能出現(xiàn)增加的情況;相對豐度沒有變化,也不能說明微生物量沒有發(fā)生變化,這與Tkacz等[24]的研究結(jié)果一致。表明在利用16S rDNA測序分析菌群結(jié)構(gòu)時,不能只考慮相對豐度的變化,還應(yīng)關(guān)注微生物量的變化。S組和Y組菌落發(fā)酵過程中微生物量的變化說明NIT促進(jìn)了Lactococcus、Leuconostoc的生長,抑制了uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Lactobacillus的生長,在前期減少了腸桿菌屬的微生物量,中、后期增加了乳酸菌菌屬的微生物量。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),NIT與OD600 nm有極顯著相關(guān)性,進(jìn)一步分析各菌屬與理化指標(biāo)的相關(guān)性。uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae的生長與pH、NIT呈負(fù)相關(guān),與TAN、OD600 nm呈正相關(guān)。3種乳酸菌Lactococcus、Leuconostoc和Lactobacillus均與pH、NIT呈負(fù)相關(guān),與OD600 nm、TAN呈正相關(guān),其中Lactococcus與NIT有顯著相關(guān)性(ry52=|-0.952 7|>r0.05),Leuconostoc與NIT有極顯著相關(guān)性(ry55=|-0.968 5|>r0.01),Lactococcus、Leuconostoc與NIT的降解具有較強的相關(guān)性。張慶芳等[25]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前期培養(yǎng)液的pH值>4.5時,乳酸菌對NIT的降解以酶降解為主;pH值<4.0后,NIT的降解主要以酸降解為主。通過比較3種乳酸菌和2種乳酸菌與OD600 nm及理化指標(biāo)的相關(guān)性,研究發(fā)現(xiàn)在Y組中乳桿菌屬相比乳球菌屬對產(chǎn)酸、降解NIT能力的影響較小,其原因可能是NIT抑制了Lactobacillus的生長。亞硝酸鹽通過影響各菌屬的生長,導(dǎo)致TAN、pH在酸菜勻漿中發(fā)生變化,進(jìn)而導(dǎo)致NIT與TAN、pH有極顯著相關(guān)性。

4 結(jié)論

亞硝酸鹽與總酸、OD600 nm的相關(guān)性為極顯著負(fù)相關(guān),與pH的相關(guān)性為極顯著正相關(guān),亞硝酸鹽的降解與Lactococcus、Leuconostoc具有較強的相關(guān)性,亞硝酸鹽促進(jìn)了Lactococcus、Leuconostoc的生長,乳酸菌屬對東北酸菜發(fā)酵起到了重要作用,當(dāng)達(dá)到發(fā)酵后期時,發(fā)酵體系中的亞硝酸鹽會被乳酸菌降解至安全值以下,從而消除了人們對東北酸菜中亞硝酸鹽安全性的疑慮。