尖孢鐮刀菌cox1基因的生物信息學鑒定及克隆

□文/田雨純 趙丹*

關鍵字：尖孢鐮刀菌；cox1基因；生物信息學

尖孢鐮刀菌為白色氣生菌絲，是植物枯萎病菌的病原菌，是一種土傳病原性真菌并廣泛分布于世界各地，具有致病力強、致病范圍廣等特點［1］。從初發到大面積泛濫只需2～3 年，其發病率通常為10%～30%，病情嚴重的年份發病率可達50%，甚至還會絕收，嚴重影響植株果實產量［2］，研究其內部主要成分并有針對性地研制相關藥物抑制病菌生長成了刻不容緩的任務。

cox1（細胞色素c氧化酶第I亞基）是呼吸復合物IV的3 個線粒體DNA 編碼的亞基（MTCO1，MTCO2，MTCO3）中的1 個。它從還原的細胞色素c 中收集電子，并將其轉移到氧氣中以產生水。釋放的能量用于跨線粒體內膜傳輸質。

本研究對尖孢鐮刀菌cox1 基因及蛋白進行了理化性質、信號肽、親/疏水性、跨膜結構、蛋白質二級結構、蛋白質三級結構等進行預測和分析。運用生物信息學相關知識為植物保護病菌抑制領域提供一定運用價值。

一、材料與方法

（一）序列檢索

在NCBI 中進行BLAST 分析，檢索尖孢鐮刀菌cox1基因序列及其編碼蛋白序列。茄病鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌、輪枝鐮刀菌、稻瘟病菌、立枯絲核菌、古巴假霜霉菌及稻平臍蠕孢cox1 基因及蛋白序列從NCBI蛋白數據庫中獲得。

（二）生物信息分析方法

蛋白質理化性質分析、蛋白質結構域分析、蛋白質疏水性預測、蛋白質跨膜預測（蛋白質信號肽預測）蛋白質二級結構預測以及蛋白質三級結構預測。

預測蛋白跨膜結構利用TMHMM 軟件，信號肽預測工具利用Signal P 軟件，蛋白同源性比對利用NCBI 中的BLAST X 程序，蛋白序列比對分析利用DNA MAN 軟件，蛋白進化樹繪制利用MEGA7 軟件，蛋白理化性質分析利用Protparam工具。

（三）總RNA提取及反轉錄

尖孢鐮刀菌總RNA 經傳統Trizol 法提取，照Takara Reverse Transcription System 說明書進行反轉錄。將反轉錄后的產物用ddH2O稀釋10倍，-20℃保存備用。

（四）尖孢鐮刀菌cox1基因CDS區克隆

采用PCR 的方法克隆尖孢鐮刀菌cox1 基因CDS 區，引物序列見表1。PCR 反應體系共20 微升：PCR MasterMix 10 微 升，Forward/ReversePrimer （10pmol/微 升）各0.5 微升，Template cDNA 1 微升，ddH2O 8 微升；PCR擴增條件：94℃3 分鐘，94℃30 秒，51.9℃30 秒，72℃1分鐘，35個循環；72℃延伸1.5分鐘，4℃保存［3］。

表1 引物序列

二、結果與分析

（一）尖孢鐮刀菌cox1基因克隆

BLSAT 檢索出尖孢鐮刀菌cox1 基因長1593bp，共編碼530 個氨基酸，序列如圖1 所示。尖孢鐮刀菌cox1 基因CDS區克隆結果如圖2所示，符合預期。

圖1 尖孢鐮刀菌cox1基因及蛋白質序列

圖2 尖孢鐮刀菌cox1基因電泳圖

（二）尖孢鐮刀菌cox1蛋白質的理化分析

利用生物信息分析軟件Protparam 對尖孢鐮刀菌cox1 蛋白進行理化分析，結果顯示如表2 所示。亮氨酸含量最高，含有70 個，占總氨基酸數的9.2%，甘氨酸含有50 個，占總氨基酸數的9.4%，異亮氨酸含有46個，占總氨基酸數的8.7%，半胱氨酸（Cys）含量最低，僅含有1 個，占總氨基酸數的0.2%，cox1 蛋白的氨基酸數量為530 個，其分子量為58390.82D、分子式為C2767H4174N648O698S22，cox1蛋白的理論等電點PI為8.46。

表2 蛋白質的理化性質分析

（三）尖孢鐮刀菌cox1蛋白信號肽分析

信號肽主要由三部分組成：n 區（n-region）為正電荷的氨基酸；疏水區（h-region）由9個或更多的以中性氨基酸為主組成；加工區（c-region）是信號肽酶切割信號肽的部位［4］。使用在線網站SignalP4.1 Server 預測cox1 蛋白信號肽情況，具體結果如圖3 所示，綜合評估推測cox1 蛋白不存在信號肽，也不跨膜，在細胞質中合成后，不進行蛋白轉運，直接在細胞質基質中與代謝底物相互作用，屬于非分泌型蛋白質［5］。

圖3 尖孢鐮刀菌cox1蛋白質信號肽

（四）尖孢鐮刀菌cox1蛋白的親疏水性分析

不同的氨基酸側鏈基團極性不同，導致其組成的蛋白質有一定的親/疏水性。通過在線分析網站對cox1蛋白的疏水性進行研究，如圖4 所示。橫軸表示的是氨基酸的位置，縱軸代表的是氨基酸平均疏水指標，并且圖中的正值和負值分別表示的是疏水性和親水性，正值越大，表明疏水性越強，負值越大，表明親水性越強［6］。結果表明，cox1 蛋白的最大疏水值（即最小親水值）出現在第195 位氨基酸，最小疏水值（即最大親水值）出現在第443 位氨基酸，在圖7 中呈現了親水性氨基酸和疏水性氨基酸的分布，肽鏈中疏水性氨基酸殘基數量明顯多于親水性氨基酸殘基，因此可以推測cox1 蛋白為疏水性蛋白。

圖4 尖孢鐮刀菌cox1蛋白的疏水性分析

（五）尖孢鐮刀菌cox1蛋白的跨膜結構分析和預測

通過在線網站預測蛋白跨膜結構，尖孢鐮刀菌cox1蛋白進行蛋白跨膜結構預測（圖5）。橫軸表示的是氨基酸的位置，縱軸代表的是跨膜結構的可能性［7］，圖5 結果顯示，尖孢鐮刀菌cox1蛋白存在12個跨膜區域，因此可推測cox1蛋白為十二層跨膜結構蛋白。

圖5 尖孢鐮刀菌cox1蛋白的跨膜分析圖

（六）尖孢鐮刀菌cox1蛋白序列比對與進化分析

通過NCBI查找發現，尖孢鐮刀菌cox1蛋白有530個氨基酸，用DNA MAN軟件把其氨基酸的序列與茄病鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌、輪枝鐮刀菌、稻瘟病菌、立枯絲核菌、稻平臍蠕孢cox1 蛋白序列進行對比，結果顯示（圖6），不同生物物種cox1蛋白序列存在一定的序列一致性，圖7所示是9個物種的系統進化樹。

圖6 9個物種cox1氨基酸序列比對圖

圖7 9個物種cox1氨基酸序列系統進化樹

（七）尖孢鐮刀菌cox1蛋白的二級、三級結構預測

蛋白質二級結構作為一級結構和三級結構的紐帶，對其的預測可以為三級結構和功能提供大量信息，如設計蛋白質突變體或確定蛋白質空間結構及功能［8］。

利用二級結構預測網站的α-螺旋占比較多為55.66%，片狀結構（β-折疊和β-轉角）為5.28%，無規則卷曲為39.06%（圖8），由此推斷，cox1蛋白二級結構中最主要的結構元件是α-螺旋，此外無規則卷曲和片狀結構分散于整個蛋白質中，且N-末端存在無規則卷曲形式，C-末端也存在無規則卷曲。

圖8 尖孢鐮刀菌cox1蛋白的二級結構預測

蛋白質的三級結構是由多肽鏈在二級結構的基礎上經過進一步盤繞、折疊形成的復雜三維構象，這些二級結構主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲，它們之間通過側鏈基團的相互作用借助次級鍵形成三級結構。Cox1蛋白三級結構預測通過網站建模得圖（圖9），如圖可看出α-螺旋占主要結構部分，無規則卷曲和片狀結構分散于整個蛋白質中。

圖9 尖孢鐮刀菌cox1蛋白質三級結構預測圖

三、結論與討論

本研究結果獲得克隆尖孢鐮刀菌cox1 基因CDS 序列1593bp，同時為探究cox1 蛋白的未知生物學功能提供了新思路，也為當下植物保護領域，植物真菌病害的防治打下了一定理論基礎，結合生物信息學可研制更高效、低成本、對環境友好的綠色殺菌劑。

生物信息學（bioinformatics）是一門新興的交叉學科，綜合運用了生物學、數學、計算機科學和工程學。它可以應用各種數據庫解釋生命科學研究中發現的海量數據，所以被廣泛應用于生命科學中的各個領域［9］，以互聯網為媒介、數據庫為載體、利用數學和計算機科學對生物學數據進行存儲、檢索和處理分析，并進一步挖掘和解讀生物學數據，它是一門理論概念與實踐應用并重的學科［10］。

本研究運用生物信息學軟件對尖孢鐮刀菌cox1 基因進行克隆，并對cox1蛋白從理化性質、信號肽、親/疏水性、跨膜結構、蛋白質二級結構、蛋白質三級結構等方面進行預測和分析。結果表明尖孢鐮刀菌cox1 基因CDS序列1593bp，編碼530 個氨基酸，Cox1 蛋白為堿性氨基酸，不存在信號肽，合成后就在核糖體處發揮作用，不存在運輸，屬于非分泌型蛋白質，分泌蛋白，疏水性較強，較穩定，有明顯的跨膜現象。cox1 蛋白二級結構中α-螺旋占主要結構部分，此外無規則卷曲和片狀結構分散于整個蛋白質中，cox1 蛋白三級結構預測結果同樣證實了二級結構成分含量的準確性，與二級結構結論相一致。cox1 蛋白在不同物種之間同源性較高，序列比對一致性較高，證明了該蛋白在同系同物種進化過程中發揮著至關重要的作用。