LncRNA SNHG10對脂多糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷的影響

修晟堯，郭楠，凌書策，肖珉，常佩芬

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院心血管科，北京100010；2 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院ICU

近年來，由于人口老齡化和城鎮(zhèn)化進程的快速發(fā)展，中國心血管疾病患病人數(shù)和發(fā)病人數(shù)逐年增加，2016年心血管疾病病死率位居第一，其中心血管疾病患病人數(shù)約有2.9億［1］。血管內(nèi)皮細胞是維持血管動態(tài)平衡的主要因素，參與腫瘤細胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等［2-4］，血管內(nèi)皮功能紊亂易造成多種疾病的發(fā)生，如動脈粥樣硬化、高血壓等［5］。研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖（LPS）可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）細胞血管的生成和轉(zhuǎn)移，促進其凋亡和炎癥反應(yīng)［6-7］。因此，本研究以LPS誘導(dǎo)HUVEC細胞，構(gòu)建體外細胞模型。研究顯示，長鏈非編碼RNA（lncRNAs）在多種心血管疾病中異常表達［8］，參與心血管疾病的細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和氧化應(yīng)激等病理過程［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)MALAT1可抑制HUVEC增殖［11］。CHEN等［12］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HULC在LPS刺激HUVEC后表達上調(diào)，下調(diào)HULC可促進LPS對細胞的活性，抑制細胞凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。XING等［13］研究表明，通過對MIAT和miR-330-5p在LPS誘導(dǎo)的敗血癥性心肌病的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激中發(fā)現(xiàn)，MIAT、miR-330-5p表達均上調(diào)，干擾MIAT或過表達miR-330-5p可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的敗血癥性心肌病炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。小核仁RNA宿主基因10（SNHG10）在胃癌、非小細胞肺癌和胰腺癌等疾病中表達上調(diào)，參與細胞的增殖、凋亡和侵襲等［14-16］。2020年1月—2022年12月，我們以HUVEC為研究對象構(gòu)建體外模型，探討SNHG10對LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞活力、凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 LPS購自Sigma公司；HUVEC購自北京協(xié)和細胞資源中心；LipofectamineTM2000試劑盒、TRIzol試劑盒、Prime Script RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Master Mix試劑盒購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自美國Gibco公司、DMEM高糖培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒、DMSO溶液及質(zhì)粒（si-NC、si-SNHG10）由北京索萊寶科技有限公司合成純化；Buffer溶液、Annexin V-FITC和PI購自北京碧云天生物技術(shù)有限公司；Ki-67抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體和GAPDH抗體購自博奧森生物技術(shù)有限公司；TNF-α試劑盒、IL-6試劑盒、IL-1β試劑盒、MDA試劑盒和SOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 細胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC在含10 %胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2天換1次培養(yǎng)基。

1.3 LPS合適濃度篩選 取對數(shù)生長期的HUVEC，加入胰酶消化重懸細胞，然后接種到96孔板內(nèi)，每孔1×105個，常規(guī)培養(yǎng)24 h。待細胞生長融合至70%~80%時，用0、50、100、500 ng/mL的LPS處理細胞。TRIzol試劑盒提取細胞的總RNA，測定其含量，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板按照SYBR Green Master Mix試劑盒擴增PCR。以18S rRNA為對照，采用2-ΔΔCt法計算HUVEC細胞中SNHG10相對表達量。根據(jù)SNHG10相對表達量選取LPS最適濃度為500 ng/mL進行后續(xù)實驗。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染與分組 取對數(shù)生長期的HUVEC，加入胰酶消化重懸細胞，然后接種到24孔內(nèi)，每孔1×105個，常規(guī)培養(yǎng)24 h。待細胞生長融合至70%~80%時，分別將si-NC、si-SNHG10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HUVEC細胞后加入濃度為500 ng/mL LPS處理（分別記為LPS+si-NC組、LPS+si-SNHG10組），選擇未行任何處理的細胞為Control組，僅加入500 ng/mL LPS處理的細胞為LPS組，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集對數(shù)生長期細胞。

1.5 各組細胞活力和凋亡率檢測 采用CCK-8法。取各組細胞加入20 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，在酶標儀450 nm波長下檢測細胞吸光度值。流式細胞儀檢測細胞凋亡率：取各組細胞加入胰酶消化細胞，接種到6孔板，每孔1×105個。加入Buffer溶液重懸細胞，然后每孔內(nèi)依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后避光反應(yīng)15 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 各組HUVEC中SNHG10 mRNA相對表達量檢測 采用RT-qPCR法。取各組HUVEC，TRIzol試劑盒提取各組細胞的總RNA，測定其含量，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板按照SYBR Green Master Mix試劑盒擴增PCR。SNHG10正向引物：5′-GTTGGTCTCTTGGGAGGTAG-3′，反向引物：5′-CGCCACGACGAACTGCATGC-3′；18S rRNA正向引物：5′-CTACCACATCCAAGGAAGC-3′，反向引物：5′-TTTTCGTCACTACCTCCCC-3′。以18S rRNA作為內(nèi)部對照，采用2-ΔΔCt法計算SNHG10 mRNA相對表達量。

1.7 各組Ki-67、Bcl-2和Bax蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取各組HUVEC，加入RIPA蛋白裂解液，冰浴裂解細胞，離心收集上清，在SDS-PAGE電泳處理后轉(zhuǎn)PVDF膜內(nèi)，加入脫脂牛奶封閉孵育1 h，加入Ki-67抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體和GAPDH抗體，4 ℃孵育，TBST洗滌，加入二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌，通過加入化學(xué)發(fā)光液顯影，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.8 各組TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、SOD檢測 采用ELISA法。取各組HUVEC細胞，加入胰酶消化細胞，離心棄上清，PBS清洗，然后按照TNF-α試劑盒、IL-6試劑盒、IL-1β試劑盒、MDA試劑盒和SOD試劑盒的說明書進行操作，檢測細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA和SOD。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prism 7.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以表示，多組間比較采用單因素方差分析（組間兩兩比較采用SNK檢驗）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組SNHG10表達、HUVEC細胞活力和凋亡率比較 與Control組相比，LPS組HUVEC內(nèi)SNHG10表達、細胞凋亡率升高（P均<0.05），而細胞活力降低（P<0.05）；與LPS+si-NC組相比，LPS+si-SNHG10組HUVEC內(nèi)SNHG10表達、細胞凋亡率降低（P均<0.05），而細胞活力升高（P<0.05）。見表1。

表1 各組SNHG10表達、HUVEC細胞活力和凋亡率比較（）

表1 各組SNHG10表達、HUVEC細胞活力和凋亡率比較（）

注：與Control組比較，*P<0.05；與LPS+si-NC組比較，#P<0.05。

組別Control組LPS組LPS+si-NC組LPS+si-SNHG10組F P細胞凋亡率（%）4.7 ± 0.8 26.1 ± 1.5*23.1 ± 1.2 16.8 ± 0.9#209.749<0.05 SNHG10相對表達量1.05 ± 0.04 3.12 ± 0.25*3.24 ± 0.19 1.88 ± 0.11#177.289<0.05細胞活力（%）99.4 ± 5.9 48.9 ± 3.4*45.4 ± 2.8 75.6 ± 4.1#107.996<0.05

2.2 各組Ki-67、Bcl-2和Bax蛋白表達比較 與Control組相比，LPS組HUVEC內(nèi)Bax蛋白表達升高（P<0.05），Ki-67蛋白和Bcl-2蛋白表達降低（P均<0.05）；與LPS+si-NC組相比，LPS+si-SNHG10組HUVEC內(nèi)Bax蛋白表達降低（P<0.05），而Ki-67蛋白和Bcl-2蛋白表達升高（P均<0.05）。見表2。

表2 各組Ki-67、Bcl-2和Bax蛋白表達比較（）

表2 各組Ki-67、Bcl-2和Bax蛋白表達比較（）

注：與Control組比較，*P<0.05；與LPS+si-NC組比較，#P<0.05。

組別Control組LPS組LPS+si-NC組LPS+si-SNHG10組F P Bax 0.98 ± 0.07 1.75 ± 0.12*1.68 ± 0.11 1.32 ± 0.07#41.815<0.05 Ki-67 1.03 ± 0.05 0.47 ± 0.05*0.52 ± 0.04 0.74 ± 0.06#76.627<0.05 Bcl-2 1.01 ± 0.04 0.38 ± 0.03*0.42 ± 0.03 0.65 ± 0.05#169.831<0.05

2.3 各組TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 與Control組相比，LPS組HUVEC內(nèi)TNF-α、1L-6和1L-1β表達升高（P均<0.05）；與LPS+si-NC組相比，LPS+si-SNHG10組HUVEC內(nèi)TNF-α、1L-6和1L-1β表達降低（P均<0.05）。見表3。

表3 各組TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（pg/mL，）

表3 各組TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（pg/mL，）

注：與Control組比較，*P<0.05；與LPS+si-NC組比較，#P<0.05。

組別Control組LPS組LPS+si-NC組LPS+si-SNHG10組F P 1L-1β 149.8 ± 9.2 683.2 ± 32.4*664.5 ± 38.1 402.6 ± 21.3#250.359<0.05 TNF-α 104.5 ± 11.2 553.4 ± 29.1*536.6 ± 33.0 289.2 ± 25.1#205.713<0.05 1L-6 123.9 ± 17.5 657.0 ± 45.1*634.5 ± 33.1 363.3 ± 22.4#193.656<0.05

2.4 各組MDA含量和SOD活性比較 與Control組相比，LPS組HUVEC內(nèi)MDA表達升高（P<0.05），SOD活性降低（P<0.05）；與LPS+si-NC組相比，LPS+si-SNHG10組HUVEC內(nèi)MDA表達降低（P<0.05），SOD活性升高（P<0.05）。見表4。

表4 各組MDA含量和SOD活性比較（）

表4 各組MDA含量和SOD活性比較（）

注：與Control組比較，*P<0.05；與LPS+si-NC組比較，#P<0.05。

組別Control組LPS組LPS+si-NC組LPS+si-SNHG10組F P SOD（U/mL）26.7 ± 2.4 9.8 ± 0.9*10.5 ± 1.1 17.4 ± 0.9#86.193<0.05 MDA（mmol/mL）10.8 ± 1.1 35.4 ± 2.3*33.2 ± 2.7 16.4 ± 1.8#104.895<0.05

3 討論

血管內(nèi)皮細胞損傷參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，而凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞氧化損傷的重要原因［17-18］。多數(shù)研究采用HUVEC作為研究心血疾病實驗?zāi)Ｐ停鳯PS誘導(dǎo)的HUVEC氧化損傷常作為體外模型［19-20］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)HUVEC中細胞活力降低；細胞凋亡水平增加，與細胞凋亡相關(guān)的蛋白Bcl-2下調(diào)，而Bax表達上調(diào)；與炎癥反應(yīng)相關(guān)的TNF-α、1L-6和1L-1β表達升高；與氧化應(yīng)激有關(guān)的MDA含量升高、SOD活性降低。IL-6、TNF-α和IL-1β是細胞炎性損傷中的重要促炎性因子，在心血管疾病中發(fā)揮重要作用［21］。MDA含量的高低可用于測量細胞氧化應(yīng)激，間接反映氧化自由基的損傷；SOD是一種抗氧化酶，可改善氧化自由基引起的細胞氧化損傷［22-23］。本研究結(jié)果證實，LPS可誘導(dǎo)HUVEC細胞的凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，與HOU等［21］研究結(jié)果相似。

越來越多證據(jù)顯示，長鏈非編碼RNA在LPS誘導(dǎo)腫瘤疾病中發(fā)揮重要作用。如在骨關(guān)節(jié)炎研究中，LPS可降低骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的活力，促進細胞損傷和炎性因子的分泌，下調(diào)GAS5表達；過表達GAS5可緩解LPS誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞引起細胞活力、凋亡和炎癥反應(yīng)［24］，本研究結(jié)果與之相反。ZHOU等［25］研究發(fā)現(xiàn)，通過人肺成纖維細胞建立LPS誘導(dǎo)的肺損傷模型，結(jié)果顯示，LPS處理細胞后，SNHG16表達下調(diào)，敲低SNHG16可以減輕LPS誘導(dǎo)的細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，促進細胞活力。CHEN等［26］研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)HMEC細胞后可促進炎性因子IL-6分泌，HULC、UCA1和MALAT-1表達上調(diào)，抑制HULC、UCA1和MALAT-1表達可減緩LPS誘導(dǎo)HMEC細胞的炎性因子分泌。

SNHG10是小核仁RNA宿主基因家族成員之一，是新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA［14］。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNHG10表達上調(diào)受抑可抑制細胞增殖和轉(zhuǎn)移，促進細胞凋亡，SNHG10可靶向調(diào)控miR-150-5p在胃癌中的作用［27］。LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷發(fā)病機制較復(fù)雜，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)HUVEC后，SNHG10表達上調(diào)；干擾SNHG10可促進LPS誘導(dǎo)HUVEC中細胞活力、SOD活性和Bcl-2蛋白表達增加，抑制細胞凋亡、Bax蛋白、TNF-α、1L-6和1L-1β和MDA含量；干擾SNHG10可對血管內(nèi)皮氧化損傷起到保護作用，說明SNHG10在HUVEC促凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激中發(fā)揮積極作用，此為SNHG10在心血管疾病的研究提供了依據(jù)。

綜上所述，干擾SNHG10表達可以減輕LPS誘導(dǎo)的HUVEC凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激，促進細胞增殖。