沉默CCND1對肝細胞癌細胞5-氟尿嘧啶耐藥性的影響及機制

阮起超，陳松芝，丁浩，孫國芳，汪楊

1 南昌大學第二附屬醫院消化內科，南昌330006；2 南昌大學第二附屬醫院心電診斷室

肝細胞癌（HCC）是常見的原發性肝癌［1-2］，具有復發率高和對抗癌藥物耐藥的特點，治療效果較差。5-氟尿嘧啶（5-Fu）是治療HCC的藥物之一，因獲得性耐藥限制了其臨床使用。探究HCC的5-Fu耐藥機制具有重要臨床意義。細胞周期蛋白D1（CCND1）基因編碼全酶的一個不穩定調控亞基，參與協調細胞周期的DNA合成階段和線粒體生物合成［3］。高表達的癌基因CCND1與HCC等多種惡性腫瘤的復發和預后不良有關［4-7］。體外實驗發現，沉默CCND1可抑制HCC細胞增殖，抑制HCC生長［7］。然而，關于這一癌基因與HCC化療耐藥之間的相關性尚不清楚。因此，2021年1月—2022年12月，本研究探討沉默CCND1對HCC細胞5-Fu耐藥性的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 HCC細胞系（SMMC-7721、HepG2細胞）購自中國科學院細胞庫；CCND1-siRNA和NC-siRNA購自上海吉瑪制藥技術有限公司；TRIzol試劑和Lipofectamine?2000購自美國Invitrogen公司；FACS Calibur?流式細胞儀購自美國BD Biosciences公司；熒光分析儀購自芬蘭Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國Sigmae-Aldrich公司；I抗CCND1、磷酸化組蛋白（γ-H2AX）、同源重組修復蛋白（RAD51）和β-actin購自美國Abcam公司。

1.2 細胞培養、轉染及5-Fu暴露 將HCC細胞置于杜氏改良Eagle培養基中，并加入10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素于增濕空氣中培養。在細胞達90%融合率時，將細胞隨機分別分為HepG2+NC-siRNA組、HepG2+CCND1-siRNA組和SMMC-7721+NC-siRNA組、SMMC-7721+CCND1-siRNA組，分別用靶向CCND1的siRNA（CCND1-siRNA）、陰性對照siRNA（NC-siRNA）轉染細胞。轉染48 h后取各組細胞置于含10 μg/mL 5-Fu的培養基中培養48 h。

1.3 CCND1 mRNA表達檢測 收集轉染后的各組細胞。TRIzol試劑提取總RNA，按照說明書，使用PrmeScript RT試劑盒將其反轉錄為cDNA，用熒光定量PCR預混液進行實時熒光定量PCR：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min循環40次。采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量，以β-actin作為參照基因。CCND1上游引物序列5′-CCCTCGGTGTCCTACTTCAA-3′，下游引物序列5′-GTGTTCAATGAAATCGTGCG-3′；β-actin上游引物序列5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物序列5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。

1.4 細胞活力檢測 取各組細胞，使用CCK-8試劑盒進行細胞活力測定。將各組細胞接種至96孔板中，加入10 μL的CCK-8試劑孵育2 h，重復3次，最后用熒光分析儀測量波長450 nm處的光密度（OD）值，取3次平均值。以OD450代表細胞活力。

1.5 細胞凋亡率檢測 取各組細胞，使用FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率。PBS洗滌，重懸，用FITC Annexin V和PI雙重染色后，采用流式細胞儀分析細胞混合物。細胞凋亡率=流式細胞儀散點圖右上象限百分率+右下象限百分率。

1.6 CCND1、DNA修復相關蛋白（γ-H2AX、RAD51）表達檢測 采用Western blotting法。取轉染后及5-Fu培養后各組細胞，RIPA法提取總蛋白，用BCA法測定，加入樣品蛋白20 mg，10% SDS-PAGE凝膠電泳后轉移至PVDF膜。分別加入CCND1（1∶1 000）、γ-H2AX（1∶1 000）、RAD51（1∶1 000）和β-actin（1∶5 000）一抗，4 ℃孵育過夜，加入HRP結合的二抗進行孵育。用化學發光法進行檢測，Image J軟件分析結果，目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值為目的蛋白相對表達量。

1.7 統計學方法 采用GraphPad Prism7.0軟件。符合正態分布的計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多個時間點比較采用重復測量方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組CCND1 mRNA、蛋白表達比較 與HepG2+NC-siRNA組比較，HepG2+CCND1-siRNA組CCND1 mRNA、蛋白表達低（P均<0.05）；與SMMC-7721+NC-siRNA組比較，SMMC-7721+CCND1-siRNA組CCND1 mRNA、蛋白表達低（P均<0.05）。見表1。

表1 各組CCND1 mRNA、蛋白表達比較（）

表1 各組CCND1 mRNA、蛋白表達比較（）

注：與HepG2+NC-siRNA組比較，*P<0.05；與SMMC-7721+NC-siRNA組比較，#P<0.05。

CCND1蛋白1.00 ± 0.08 0.20 ± 0.02*1.00 ± 0.10 0.11 ± 0.05#組別HepG2+NC-siRNA組HepG2+CCND1-siRNA組SMMC-7721+NC-siRNA組SMMC-7721+CCND1-siRNA組CCND1 mRNA 1.00 ± 0.19 0.22 ± 0.05*1.00 ± 0.16 0.25 ± 0.04#

2.2 各組細胞活力、凋亡率比較 與HepG2+NC-siRNA組比較，HepG2+CCND1-siRNA組5-Fu暴露72 h的OD450低（P<0.05），凋亡率高（P<0.05）；與SMMC-7721+NC-siRNA組比較，SMMC-7721+CCND1-siRNA組5-Fu暴露72 h的OD450低（P<0.05），凋亡率高（P<0.05）。見表2。

表2 各組5-Fu暴露下細胞活力、凋亡率比較（）

表2 各組5-Fu暴露下細胞活力、凋亡率比較（）

注：與HepG2+NC-siRNA組比較，*P<0.05；與SMMC-7721+NC-siRNA組比較，#P<0.05。

組別HepG2+NC-siRNA組HepG2+CCND1-siRNA組SMMC-7721+NC-siRNA組SMMC-7721+CCND1-siRNA組凋亡率（%）34.26 ± 4.11 58.56 ± 6.79*47.62 ± 5.03 72.54 ± 8.41#OD450暴露12 h 0.12 ± 0.03 0.13 ± 0.05 0.12 ± 0.05 0.12 ± 0.04暴露24 h 0.22 ± 0.04 0.18 ± 0.04 0.18 ± 0.04 0.14 ± 0.04暴露36 h 0.45 ± 0.06 0.25 ± 0.03 0.34 ± 0.05 0.20 ± 0.03暴露48 h 0.62 ± 0.07 0.40 ± 0.08 0.57 ± 0.06 0.32 ± 0.08暴露72 h 0.87 ± 0.09 0.57 ± 0.07*0.74 ± 0.08 0.47 ± 0.07#

2.3 各組細胞DNA損傷修復相關蛋白表達比較 與HepG2+NC-siRNA組比較，HepG2+CCND1-siRNA組5-Fu暴露下γ-H2AX蛋白表達高（P<0.05），RAD51蛋白表達低（P<0.05）；與SMMC-7721+NC-siRNA組比較，SMMC-7721+CCND1-siRNA組5-Fu暴露下γ-H2AX蛋白表達高（P<0.05），RAD51蛋白表達低（P<0.05）。見表3。

表3 各組5-Fu暴露下γ-H2AX、RAD51蛋白表達比較（）

表3 各組5-Fu暴露下γ-H2AX、RAD51蛋白表達比較（）

注：與HepG2+NC-siRNA組比較，*P<0.05；與SMMC-7721+NC-siRNA組比較，#P<0.05。

RAD51蛋白1.00 ± 0.04 0.38 ± 0.05*1.00 ± 0.08 0.23 ± 0.10#組別HepG2+NC-siRNA組HepG2+CCND1-siRNA組SMMC-7721+NC-siRNA組SMMC-7721+CCND1-siRNA組γ-H2AX蛋白1.00 ± 0.10 1.70 ± 0.19*1.00 ± 0.10 6.89 ± 0.15#

3 討論

HCC是全球癌癥死亡的第4大原因，也是肝硬化死亡的主要原因［8］。HCC的預后極差，其死亡率接近世界范圍內的發病率。在我國，HCC最常見的病因是病毒性肝炎，而國外最常見的病因是酒精性肝病。目前HCC的治療方案包括肝切除、肝移植、肝動脈化療栓塞、化療、免疫治療、靶向治療等［1，8］。化療是HCC重要的輔助治療方法之一，但因內在耐藥或獲得性耐藥限制了其臨床使用。HCC的耐藥機制復雜，有研究表明可能與抗癌藥物泵出腫瘤細胞的藥物外排轉運體的表達增加、DNA損傷修復能力的增強、凋亡信號通路的失活、自噬、miRNA和lncRNA失調等多種因素密切相關［9-10］。其中5-Fu是全身局部化療過程中最常用的化療藥物，可阻斷胸腺嘧啶合成，從而誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡［11］。因此，探究HCC的5-Fu耐藥機制具有重要的臨床意義。

癌細胞DNA修復能力高，易放療或化療耐藥，因此靶向DNA修復機制可能提高放療和化療的療效［12-13］。作為細胞周期機制的重要組成部分，CCND1在DNA修復中起重要作用，與癌癥的化療耐藥相關［14-15］。研究表明，γ-H2AX用于評估修復切口核酸酶引起的DNA鏈斷裂，RAD51用于測量同源重組在鏈間修復交聯的活性［16］。MARAMPON等［12］報道，沉默CCND1通過促進放療誘導的DNA損傷而增強前列腺癌細胞的放療敏感性。在沉默CCND1誘導的套細胞淋巴瘤細胞DNA損傷中，CCND1發揮保持基因組穩定性的重要作用［17］。ZHONG等［13］研究結果表明，沉默CCND1可以抑制RAD51并誘導細胞周期G0/G1期阻滯，從而增加BRCA1野生型卵巢癌細胞對奧拉帕利化療的敏感性。本研究首先構建CCND1沉默模型，并通過檢測CCND1 mRNA、蛋白表達驗證其沉默效率。5-Fu暴露下沉默CCND1后，肝癌細胞的細胞活力下降，凋亡率上升，表明沉默CCND1增加HCC對5-Fu的敏感性。進一步研究表明，在5-Fu暴露下，沉默CCND1升高了兩種肝癌細胞中γ-H2AX表達，降低了RAD51表達，這表明沉默CCND1可通過抑制癌細胞的DNA損傷修復能力參與調節癌細胞對放化療的耐藥性。

綜上所述，CCND1是HCC和5-Fu抗性的關鍵介導因子，沉默CCND1可以通過靶向DNA損傷修復能力增強HCC細胞對5-Fu的敏感性。這一發現為5-Fu治療難治性HCC提供了潛在治療靶點。