畢節地區產ESBLs大腸埃希菌的耐藥性及基因分型研究

羅 嫚，吳太琴，胡 夷

（畢節市中醫醫院檢驗科，貴州 畢節 551700）

大腸埃希菌是人體腸道當中的一種正常且重要的菌群，如果機體出現抵抗力、免疫力下降的情況，或者是遭受細菌侵襲，且已進入到腸道外組織器官，此時大腸埃希菌便有引起多種疾病的可能，比如肺炎、尿路感染及敗血癥等[1]。近年來，伴隨抗菌藥物種類的日漸增多，使用頻率、量的逐漸增加，使得大腸埃希菌的耐藥性也呈現出不斷增加的趨勢[2]；需指出的是，產生超廣譜β- 內酰胺酶（ESBLs）是大腸埃希菌耐藥的典型機制。產ESBLs 的大腸埃希菌有多種基因型，且在各地區、不同國家之間，有著不同的流行情況[3]。為深入剖析畢節地區產ESBLs 大腸埃希菌的實際耐藥性情況以及基因分型情況，本文特選取本院所采集的產ESBLs 大腸埃希菌菌株開展藥敏試驗，并檢測其基因分型，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

在2019 年12 月至2020 年12 月這一階段內，以門診、住院病人為對象，共選取2217 例，對其各類標本進行采集（如血液標本、膿液標本、痰液標本及尿液標本等），進行培養，得到大腸埃希菌菌株85 株。其中，45 株是產ESBLs 大腸埃希菌。對于所分離的菌株，使用甘油肉湯菌株保存液在冰箱中予以保存（-20℃）。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 選用由法國生物梅里埃公司生產的VITEK 2 Compact 微生物鑒定及藥敏分析儀，杭州安譽科技有限公司生產的熒光定量PCR 儀（AGS4800型），法國生物梅里埃公司生產的革蘭陰性細菌鑒定卡及藥敏卡；選用由南京諾唯贊生物科技有限公司生產的質粒提取試劑盒及由Oxoid 公司提供的ESBLs 確證藥敏紙片；采用由鄭州博賽生物技術股份有限公司生產的M-H 瓊脂平板、麥康凱平板與血平板。

1.2.2 操作方法 （1）鑒定菌株及開展藥敏試驗。對病人感染處的標本進行采集，依據《臨床微生物檢驗標準化操作》[4]中的相關要求，開展細菌培養，并進行分純處理。用VITEK 2 Compact 微生物鑒定及藥敏分析儀、配套的藥敏卡、革蘭陰性細菌鑒定卡進行實時鑒定，并開展藥敏試驗。（2）ESBLs 確證試驗。經藥敏卡證實為產ESBLs 菌株后，參照雙紙片協同法〔美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）所推薦〕開展規范化的表型確證試驗操作，即：分別用兩組紙片實施試驗（一組為頭孢他啶及頭孢他啶/ 克拉維酸，另外一組是頭孢噻肟及頭孢噻肟/ 克拉維酸）；如果與不加克拉維酸相比，加克拉維酸后抑菌環直徑增加≥5 mm，便可明確為產ESBLs 菌株。質控菌株：藥敏試驗的質控菌株為銅綠假單胞菌（ATCC27853）、大腸埃希菌（ATCC25922）；將大腸埃希菌（ATCC25922）當作ESBLs 確證試驗的陰性質控菌株，而把肺炎克雷伯菌（ATCC70063）當作其陽性質控菌株。（3）檢測ESBLs 基因型。用質粒提取試劑盒對45 株菌株進行質粒提取。基本的操作流程：將菌株保存液從冰箱中拿出，使其恢復至室溫狀態，然后轉種血平板，于特定溫度下（37℃）持續培養24 h；選1 個菌落，置入5 mL 肉湯管進行增菌處理，然后用質粒提取試劑盒進行菌液的質粒提取。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，提取的質粒保存于-20℃的環境中。對各基因型實施PCR 擴增。分別取核酸熒光PCR 檢測混合液（n×36 μL）、擴增酶（n×0.4 μL）（其中，n 代表的是樣本數），制作研究所需要的反應液。將適量反應液（36 μL）、質粒（4 μL）加入各管當中，實施PCR 擴增。PCR 擴增的基本條件：預溫2 分鐘（37℃），預變性2 分鐘（94℃），1 個循環；變性15 s（93℃），退火（60℃）及延伸1 分鐘，40 個循環。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，挑選陽性產物送至安徽通用生物股份有限公司進行測序。擴增引物序列見表1。

表1 待測基因對應的引物序列

2 結果

2.1 大腸埃希菌對于各種抗菌藥所具有的耐藥性

收集到85 株大腸埃希菌菌株，其中45 株為產ESBLs 菌株，占比為52.94%。經藥敏試驗得知，青霉烯類（厄他培南、亞胺培南）、β- 內酰胺酶抑制劑復方制劑（哌拉西林/ 他唑巴坦）對產ESBLs 菌株的抗菌作用最強，氨基糖苷類（阿米卡星）、硝基呋喃類的抗菌活性較強，磺胺類、喹諾酮類（環丙沙星、左氧氟沙星）抗菌藥的抗菌活性較弱。見表2。

表2 45 株產ESBLs 大腸埃希菌菌株對各抗菌藥的耐藥情況（%）

2.2 基因分型

對45 株產ESBLs 大腸埃希菌開展ESBLs 基因分型檢測操作，PCR 后行1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定（見圖1），挑選有條帶的PCR 擴增產物進行測序分析，測序結果顯示，產ESBLs 大腸埃希菌中攜帶CTX-M型基因的有45 株，攜帶TEM 型基因的有43 株，攜帶OXA 型基因的有32 株，攜帶SHV 型基因的有14 株，見表3。

圖1 PCR 擴增電泳圖

表3 45 株產ESBLs 大腸埃希菌的基因分布情況[株(%)]

3 討論

大腸埃希菌是一種在臨床中較為常見的條件致病菌，是造成醫院感染的典型致病菌。近年來，隨著抗菌藥種類的日漸增多，相關用藥量的不斷增大，以及用藥時間的持續增加，使得大腸埃希菌的耐藥性也呈現出隨之增加的趨勢[5]。產生ESBLs 是大腸埃希菌耐藥的典型機制。ESBLs 作為一類酶，可以對多種類型的抗菌藥進行水解，比如單酰胺環類、頭孢菌素類、青霉素類等[6-7]。產ESBLs 菌株早在1983 年便已經被成功分離檢出，自此之后，其在醫院感染當中的檢出率呈現出逐年且快速增加的趨勢[8]。產ESBLs 菌株的出現增加了抗感染治療的難度，受此影響，不僅會延長病人的住院時間，而且還會增加其治療費用及痛苦，升高死亡率[9]。本研究的結果顯示，產ESBLs 大腸埃希菌的檢出率是52.94%，此結果高于某學者[10]的研究數據，與某報道[11]的結論相一致。究其原因，可能與地區不同、使用抗菌藥的劑量、種類等存在一定差異相關。從藥敏結果得知，對于頭孢曲松、氨芐西林等β- 內酰胺環類藥物而言，產ESBLs 菌株對其耐藥率均為100%，故臨床上在選藥時，應注意避免使用此類藥；產ESBLs 菌株對氨基糖苷類以及硝基呋喃類藥物的耐藥率均小于50%，臨床上可視情況使用此類藥物進行相關治療。需要注意的是，產ESBLs 菌株對氨芐西林/ 舒巴坦這一β- 內酰胺酶抑制劑復合制劑存在顯著耐藥情況，但對哌拉西林/ 他唑巴坦卻比較敏感。究其原因，可能與他唑巴坦在抑酶方面的效果較舒巴坦好、本院較少使用哌拉西林/ 他唑巴坦相關[12]。有研究指出，產ESBLs 菌株除了對β- 內酰胺環類抗菌藥物的耐藥率較不產ESBLs 菌株高之外，對磺胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類藥物的耐藥率也較不產ESBLs 菌株高。究其原因，可能與編碼ESBLs的質粒能夠同時攜帶其他多種耐藥基因有關[13]。碳青霉烯類抗菌藥主要有厄他培南、亞胺培南等。此類藥物是對多重耐藥革蘭陰性桿菌所致感染進行治療時最佳的藥物選擇。但有研究發現，耐碳青霉烯類抗生素細菌的檢出率目前呈逐年上升的趨勢，需要引起重視。

現階段，ESBLs 的基因分型較多，除了有OXA、GES、TLA、SFO 之 外， 還 有PER、VEB、BES、TEM、SHV 及CTX-M 等[14]。本 文 圍 繞 常 見 的4 個基因分型實施檢測，即OXA、SHV、CTX-M、TEM。結果得知，檢出最多的是CTX-M 基因型，其次是TEM 基因型，此結果與相關研究[15]的結論相同。CTX-M 酶又被稱作頭孢噻肟酶，其可對頭孢曲松、頭孢噻肟進行高度的水解，本文所得到的產ESBLs 基因型主要是CTX-M，原因與頭孢曲松、頭孢噻肟在臨床中被廣泛應用相關。

綜上，畢節地區產ESBLs 大腸埃希菌基因型多為TEM、CTX-M 型，且還存在SHV、OXA 型；產ESBLs 菌株對于多種抗菌藥均存在較高的耐藥性，臨床上在選擇抗菌藥時，應注意避免選擇上述藥物，以提高用藥的準確性、合理性與有效性。