N-乙酰-D-半乳糖胺修飾頭孢克洛-殼聚糖納米乳的制備及釋藥性能研究

李華榕,鄭品勁,孔松芝,鄭心宜,郝鈺婷,梁麗娟,廖銘能

(廣東海洋大學,廣東 湛江 524000)

頭孢克洛為β-內酰胺類抗生素,屬于第二代頭孢菌素類藥物,其抗菌作用機制與其它頭孢菌素類藥物相似,主要通過與細菌細胞內的青霉素結合蛋白(PBPs)結合,抑制細菌細胞壁的生物合成而起到殺菌作用。作為市面上較為常用的抗生素藥物,頭孢克洛劑型有很多,如片劑、顆粒劑、膠囊劑、干混旋劑等。由于頭孢克洛微溶于水,頭孢克洛制劑普遍存在穩定性較差、易產生耐藥性等問題[1]。將頭孢克洛設計為適宜的載藥納米乳等緩釋制劑,可以有效降低藥物使用劑量,延長藥物在病灶部位的滯留時間,提高藥物生物利用度[2-3]。

殼聚糖具有生物降解性、細胞親和性和生物效應等獨特性質,尤其是含有游離氨基的殼聚糖,是天然多糖中唯一的堿性多糖[4]。殼聚糖微球表面富有多糖鏈,能被特異性細胞或組織識別,可靶向投遞藥物至病灶部位貯存、釋放;殼聚糖微球表面可連接功能基團,通過吸附或包裹方式負載不同藥物。殼聚糖作為藥物載體,可以穩定藥物成分,延緩或控制藥物的溶解速度,促進藥物吸收,幫助藥物到達靶器官,且具有抗酸、抗潰瘍功效,可防止藥物對胃的刺激。殼聚糖載藥納米乳的藥物釋放與殼聚糖分子量有關,一般藥物的釋放速率隨殼聚糖分子量的增大而減慢,且殼聚糖濃度越高,藥物從殼聚糖中擴散進入生物介質的速率越慢[5]。

在此,作者采用低能乳化法制備N-乙酰-D-半乳糖胺修飾頭孢克洛-殼聚糖納米乳[6],測定納米乳的粒徑和Zeta電位[7-8],通過比較納米乳和頭孢克洛混懸液的累積釋藥率、考察釋放介質和乳化劑用量對納米乳累積釋藥率的影響初步研究其釋藥性能。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

頭孢克洛(純度≥99%)、N-乙酰-D-半乳糖胺(純度≥98%)、殼聚糖(脫乙酰度 90%)、聚氧乙烯氫化蓖麻油(S25692)、磷酸二氫鉀(分析純),上海源葉生物科技有限公司;醋酸(分析純)、吐溫-80(化學純)、十二水合磷酸氫二鈉(分析純),廣東光華科技股份有限公司;實驗用水為蒸餾水。

FR124CN型電子天平,奧豪斯儀器(常州)有限公司;DL-5-B型低速大容量離心機,上海安亭科學儀器廠;TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計,上海生析超聲儀器有限公司; 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,上海羌強儀器設備有限公司;DK-98-Ⅱ型電子萬用爐(電壓220 V,AC功率1 000 W),天津泰斯特儀器有限公司;普通透析袋(分子量8 000～14 000),上海源葉生物科技有限公司。

1.2 N-乙酰-D-半乳糖胺修飾頭孢克洛-殼聚糖納米乳的制備方法

1.2.1 溶液的制備

殼聚糖醋酸溶液:精密量取1 mL醋酸于50 mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,得到2%醋酸溶液;精密稱取0.5 g 殼聚糖于燒杯中,加入2%醋酸溶液,磁力攪拌30～60 min,直至殼聚糖完全溶解,得到殼聚糖醋酸溶液,靜置,待攪拌時產生的氣泡除凈后即可使用。

PBS緩沖溶液:精密稱取磷酸二氫鉀0.011 5 g、十二水合磷酸氫二鈉0.248 6 g于50 mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,搖勻并超聲溶解5 min,得到PBS緩沖溶液,其pH值在7.3～7.5范圍內。

N-乙酰-D-半乳糖胺的PBS溶液:將適量N-乙酰-D-半乳糖胺加入到含PBS緩沖溶液的燒杯中,攪拌均勻,得到N-乙酰-D-半乳糖胺的PBS溶液。

1.2.2N-乙酰-D-半乳糖胺修飾頭孢克洛-殼聚糖納米乳的制備[9-12]

精密稱取2.4 g聚氧乙烯氫化蓖麻油于小研缽中,加入0.1 g頭孢克洛,在加熱條件下不停攪拌,使頭孢克洛全部溶解于蓖麻油中;隨后將其加入到含4.5 g乳化劑吐溫-80的燒杯中,磁力攪拌30 min,得到油相;依次將6.5 mLN-乙酰-D-半乳糖胺的PBS溶液、5.5 mL殼聚糖醋酸溶液加入到另一空燒杯中,攪拌均勻,得到水相;將油相緩慢加入到水相中, 磁力攪拌30 min后,超聲15 min,得到N-乙酰-D-半乳糖胺修飾頭孢克洛-殼聚糖納米乳(以下簡稱納米乳)。

1.3 頭孢克洛標準曲線的繪制

精密稱取頭孢克洛10 mg于50 mL容量瓶中,加入適量蒸餾水超聲溶解并定容至刻度,搖勻,得到濃度為0.2 mg·mL-1的頭孢克洛標準溶液。分別精密量取0.05 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL頭孢克洛標準溶液于10 mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,搖勻,靜置10 min,采用紫外分光光度法測定263 nm處吸光度。以濃度(c,μg·mL-1)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線,擬合得線性回歸方程為A=0.02154c+0.0112,R2=0.9999。頭孢克洛濃度在1.0～50.0 μg·mL-1范圍內與吸光度線性關系良好。

1.4 頭孢克洛混懸液的制備

精確稱取與納米乳所含藥物等量的頭孢克洛,加入5 mL蒸餾水,混勻,得到頭孢克洛混懸液。

1.5 包封率和載藥量的測定

精密量取4 mL納米乳于透析袋中,用透析袋夾夾緊兩端,置于裝有200 mL蒸餾水的燒杯中;在30 ℃下磁力攪拌(100 r·min-1)3 h后,取一定量透析介質,采用紫外分光光度法測定263 nm處吸光度(A)。分別按式(2)、式(3)計算包封率和載藥量:

(1)

(2)

(3)

式中:m0為頭孢克洛的加入質量,mg;m1為透析介質中頭孢克洛的質量,mg;m為4 mL納米乳的質量,mg。

1.6 體外累積釋藥率的測定[13-14]

采用透析法測定納米乳的體外累積釋藥率。精密量取5 mL納米乳于透析袋中,用透析袋夾夾緊兩端,置于裝有350 mL釋放介質的溶出杯中, 將溶出杯置于恒溫磁力攪拌器上,在30 ℃、100 r·min-1條件下進行釋藥;分別在0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h吸取5 mL釋放介質,同時補充5 mL等溫新鮮釋放介質。 將取出的釋放介質經0.45 μm微孔濾膜過濾后,采用紫外分光光度法測定 263 nm處吸光度,并按式(4)計算納米乳的累積釋藥率(Q):

(4)

式中:cn為第n次取出釋放介質中頭孢克洛濃度,mg·mL-1;ci為第i次取出釋放介質中頭孢克洛濃度,i=n-1,mg·mL-1;V0為釋放介質總體積,即350 mL;Vi為取出的釋放介質體積,即5 mL;m為納米乳所含頭孢克洛總質量,mg。

2 結果與討論

2.1 納米乳的表征

2.1.1 粒徑分析(圖1)

圖1 納米乳的粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of nanoemulsion

由圖1可知,納米乳的粒徑在60～250 nm范圍內。

2.1.2 Zeta 電位分析(圖2)

圖2 納米乳的Zeta電位分布Fig.2 Zeta potential distribution of nanoemulsion

由圖2可知,納米乳的Zeta電位為(3.63±0.32) mV。

2.2 納米乳的包封率和載藥量(表1)

表1 納米乳的包封率和載藥量Tab.1 Encapsulation rate and drug loading rate of nanoemulsion

根據表1數據,3#、7#、8#樣品的包封率和載藥量較高且更接近,后續選用3#、7#、8#樣品進行體外釋藥性能研究。

2.3 納米乳的體外釋藥性能

2.3.1 納米乳與頭孢克洛混懸液的累積釋藥率比較

以蒸餾水為釋放介質,按1.6方法測定24 h內納米乳和頭孢克洛混懸液的累積釋藥率,結果見圖3。

圖3 納米乳和頭孢克洛混懸液的累積釋藥率-時間曲線Fig.3 Cumulative drug release rate-time curves of nanoemulsion and Cefaclor suspension

由圖3可知, 隨著時間延長,納米乳和頭孢克洛混懸液的累積釋藥率均先迅速升高。對于頭孢克洛混懸液,前2 h釋藥較快,且其累積釋藥率比納米乳的高,可能是由于,部分頭孢克洛溶于水后濃度較大, 析出較快;2 h后,其累積釋藥率升幅趨緩后趨于穩定,24 h累積釋藥率僅50.53%,這是因為,頭孢克洛微溶于水,透析袋中可能還存在未溶解的頭孢克洛,且透析袋內外的濃度達到一致時,頭孢克洛不再透膜析出,故而對其累積釋藥率有較大影響。對于納米乳,2 h時,其累積釋藥率達到49.61%; 2 h后,其累積釋藥率仍逐漸升高,24 h累積釋藥率達到72.43%,可見納米乳的累積釋藥率上升趨勢相對明顯,釋藥性能更優,可能是由于,納米乳可提高藥物溶解度,從而提高藥物的生物利用度。

2.3.2 釋放介質對納米乳累積釋藥率的影響

分別以蒸餾水和pH值7.3的PBS緩沖溶液為釋放介質,按1.6方法測定24 h內納米乳的累積釋藥率,結果見圖4。

圖4 不同釋放介質中納米乳的累積釋藥率-時間曲線Fig.4 Cumulative drug release rate-time curves of nanoemulsion in different release media

由圖4可知,以PBS緩沖溶液為釋放介質時,納米乳的24 h累積釋藥率僅31.87%;以蒸餾水為釋放介質時,納米乳的累積釋藥率較高,24 h累積釋藥率為72.43%,釋藥性能更優。可能是由于,頭孢克洛為弱酸性藥物,而PBS緩沖溶液的pH值為7.3, 偏堿性,弱酸性藥物在堿性環境下易解離,透析膜內非離子型多,不易轉運,對藥物穿過透析膜有一定影響,因此納米乳在PBS緩沖溶液中的累積釋藥率較低。

2.3.3 乳化劑用量對納米乳累積釋藥率的影響

乳化劑用量分別為3 g、5 g、8 g,其它條件不變,按1.2.2方法制備納米乳,按1.6方法測定24 h內納米乳的累積釋藥率,結果見圖5。

圖5 不同乳化劑用量下納米乳的累積釋藥率-時間曲線Fig.5 Cumulative drug release rate-time curves of nanoemulsions with different emulsifier dosages

由圖5可知,隨著乳化劑用量的增加,納米乳的累積釋藥率逐漸升高;當乳化劑用量為8 g時, 24 h累積釋藥率最高達到72.43%。

2.4 釋藥模型擬合

對納米乳在0.5～24 h的累積釋藥率-時間曲線進行擬合,得到釋藥模型方程:零級方程:Q=1.84882t+40.18943,R2=0.5829;一級方程:ln(1-Q)=0.63021t+66.03777,R2=0.9534;Higuchi方程:Q=11.99124t1/2+24.84411,R2=0.7942。零級方程的R2為0.582 9,說明納米乳的釋藥行為與零級釋藥模型擬合度較差,納米乳并不是恒速釋放藥物;一級方程的R2為0.953 4,說明納米乳的釋藥行為符合一級釋藥模型;Higuchi方程的R2為0.794 2,說明納米乳的釋藥行為與Higuchi釋藥模型擬合度也不高,不符合Higuchi釋藥模型。

3 結論

制備的納米乳的粒徑在60～250 nm范圍內,Zeta電位為(3.63±0.32) mV;相較于頭孢克洛混懸液,納米乳的釋藥性能更優,但納米乳不適合在偏堿性環境(pH≥7.3)中釋藥;在3～8 g范圍內,隨著乳化劑用量的增加,納米乳的累積釋藥率逐漸升高,當乳化劑用量為8 g時,24 h累積釋藥率最高達到72.43%;納米乳的釋藥行為符合一級釋藥模型。納米乳是一種釋放性能較好的藥物劑型,在藥物傳遞過程中可達到緩釋效果,但該研究未優化制備納米乳的藥物配方,其包封率和載藥量偏低,因此納米乳的制備工藝有待進一步深入研究。