洋甘菊總黃酮體外抗腫瘤活性研究

龍 婷,波拉提·馬卡比力,蘭 衛*,王 瑩

(1.新疆醫科大學中醫學院,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區藥物研究所,新疆 烏魯木齊 830004;3.新疆醫科大學附屬中醫醫院,新疆 烏魯木齊 830002)

癌癥是全球死亡率最高的疾病之一,其特征是由于啟動劑的作用導致細胞機制異常或 DNA 突變,從而導致細胞不受控制異常生長[1]。多種強效合成抗癌藥物被用于臨床治療癌癥,在殺死腫瘤細胞的同時對正常細胞的毒副作用較嚴重,此外腫瘤細胞也易產生耐藥性。研究表明,可通過單獨或組合使用天然化合物來克服抗癌藥物相關的不良反應[2],其中針對黃酮類化合物的研究較多[3]。

洋甘菊(MatricariachamomiliaL.),又稱母菊,維藥名巴木乃,是菊科植物德國洋甘菊的干燥全草或花序,采收于夏秋季,是傳統醫學和民間常用藥材之一[4]。現代藥理學研究表明,洋甘菊具有抗腫瘤[5]、抗病毒、氧化應激的神經保護、抗焦慮、抗抑郁[6]、降血糖血脂[7-8]、抑菌等作用。目前,關于洋甘菊抗腫瘤活性的研究報道較少。基于此,作者采用CCK-8法研究洋甘菊總黃酮(MCTF)對人肺癌細胞A549、人胃癌細胞 AGS、人宮頸癌細胞HeLa及SiHa、人食管癌細胞 Eca-109及TE-1、人肝癌細胞HepG2體外增殖的抑制作用,并采用流式細胞術檢測洋甘菊總黃酮對SiHa細胞周期分布及凋亡率的影響,為后續進一步探究洋甘菊抗腫瘤的臨床應用提供數據參考。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

洋甘菊,經鑒定為德國洋甘菊的干燥全草。人肺癌細胞A549、人胃癌細胞AGS、人宮頸癌細胞HeLa及SiHa、人食管癌細胞Eca-109及TE-1、人肝癌細胞HepG2,均由新疆醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究院提供。

0.25%胰蛋白酶(批號 2186974)、胎牛血清(FBS,批號70101002),美國Gibco公司;DMEM培養基(批號SH30022.01)、磷酸鹽緩沖液(PBS,批號SV30010),美國Hyclone公司;青霉素+鏈霉素雙抗(批號Bj111995904),Biosharp公司;二甲基亞砜(DMSO,批號EZ6789B127),德國BioFroxx公司;細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(CCK-8,批號BA00208),北京博奧森生物技術有限公司;周期檢測試劑盒(PI,批號40301ES60),翊圣生物公司;凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC,批號AO2001-02P-G),天津三箭生物技術公司。

SW-XJ-2F型超凈臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;371型直熱式CO2恒溫培養箱,Thermo公司;TDL-5-A型低速離心機,上海安亭科學儀器廠;IX71-5-12FL/PH型倒置熒光三目顯微鏡,Roperscientific公司;Benchmurk PLUS型全波長酶標儀,Bio-Rad公司;TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡,德國Leica公司;AB104-N型電子分析天平,上海Mettler-Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 MCTF的提取

在課題組前期研究[9]的基礎上,取適量洋甘菊粉末,按料液比1∶12(g∶mL)加入70%乙醇回流提取2 h,提取3次,合并提取液,濃縮;濃縮液經D-101/AB-8 大孔吸附樹脂純化,收集洗脫液;60 ℃旋轉蒸發除去乙醇,干燥,得到含量為56%(UV)[10]的MCTF。

1.2.2 儲備液的制備

稱取MCTF約 50 mg,溶于0.5 mL DMSO中,振蕩搖勻,封口后儲存于4 ℃環境中。

1.2.3 細胞培養

A549、AGS、HeLa、SiHa、Eca-109、TE-1和HepG2細胞復蘇后分別接種于含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養基中,置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養。次日換液,及時傳代,取對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.2.4 MCTF抗腫瘤活性的測定

分別取對數生長期的A549、AGS、HeLa、SiHa、Eca-109、TE-1和HepG2細胞,用PBS緩沖液清洗2次,加入1 mL胰蛋白酶消化60 ～ 90 s,然后加入2～3 mL新鮮培養基終止消化,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,再加入1 mL DMEM培養基吹打均勻,制成單細胞懸液。單細胞懸液以每孔5×104個·mL-1接種至96孔板中,置于培養箱中培養24 h,長至40%～50%時,棄培養基,每孔加入100 μL不同濃度(25、50、100、150、200、300、450、600,μg·mL-1)的MCTF溶液,設置正常對照組(不加MCTF溶液)和空白組(不加腫瘤細胞),每孔設置3個復孔;分別在培養箱中孵育24 h、48 h后,棄培養基,加入100 μL 10%CCK-8試劑,置于培養箱中繼續孵育1 h,采用酶聯免疫檢測儀測定450 nm 處吸光度(OD)。按式(1)計算樣品對細胞增殖的抑制率,并通過Graphpad 軟件計算半數抑制濃度(IC50),以IC50值作為評價MCTF對不同腫瘤細胞的毒性指標。

(1)

1.2.5 SiHa細胞的分組及培養

SiHa細胞懸液以2×106個·mL-1接種至6孔板中,設置正常對照組、順鉑組(15 μg·mL-1)、MCTF給藥組(25、50、100,μg·mL-1),每組設置3 個復孔,培養24 h后,給藥48 h,觀察細胞形態。

1.2.6 PI 單染法檢測細胞周期變化

SiHa細胞懸液以2×106個·mL-1接種至6孔板中,設置正常對照組、順鉑組(15 μg·mL-1)、MCTF給藥組(25、50,μg·mL-1),每組設置3 個復孔,貼壁24 h后,給藥24 h;棄培養液,用預冷的PBS緩沖液清洗1次,胰蛋白酶消化,1 000 r·min-1離心5 min;棄上清,用PBS緩沖液再次洗滌,1 000 r·min-1離心5 min;棄去上清,加入預冷的70%乙醇0.5 mL,在-20 ℃冰箱中靜置12～24 h。 將固定好的細胞1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,用PBS緩沖液清洗2次,再加入0.5 mL PI染色液,避光染色15 min后上機檢測。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率

分組及給藥方式同1.2.6方法,收集消化后的SiHa細胞懸液于對應的EP管中,1 500 r·min-1離心5 min,棄上清并彈勻細胞;加入2 mL PBS緩沖液,離心5 min后,棄上清,重復操作2次;將細胞重懸于500 μL Binding Buffer中,分別加入5 μL Annexin V-FITC和PI染色液,輕輕混勻,37 ℃避光染色10 min,并在1 h內通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率,重復3次,按式(2)計算SiHa細胞總凋亡率(%):

總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率

(2)

1.3 統計學分析

2 結果與討論

2.1 MCTF對腫瘤細胞形態的影響

用倒置顯微鏡觀察各實驗組細胞,與空白對照組相比,MCTF給藥組細胞形態均發生改變,觀察到細胞密度顯著降低,且隨著MCTF濃度的增加,細胞逐漸變亮、變圓;在300 μg·mL-1、450 μg·mL-1、600 μg·mL-1濃度下,大部分腫瘤細胞均無法維持完整的細胞形態。

2.2 MCTF對腫瘤細胞增殖的抑制作用

不同濃度MCTF分別作用24 h、48 h時對腫瘤細胞增殖的抑制率如表1所示,對腫瘤細胞的IC50值如表2所示。

表1 MCTF對不同腫瘤細胞增殖的抑制率Tab.1 Inhibitory rates of different tumor cells by MCTF

表2 MCTF對不同腫瘤細胞的IC50值Tab.2 IC50 values of MCTF to different tumor

從表1、表2可以看出,MCTF對7種腫瘤細胞增殖均有不同程度的抑制作用,其中對SiHa細胞的抑制作用最強,作用24 h、48 h 時,IC50值分別為(130.23±2.98) μg·mL-1、(97.74±4.02) μg·mL-1,當MCTF濃度為200 μg·mL-1時,對SiHa細胞的抑制率高達97%以上。表明,MCTF在一定濃度范圍內對不同腫瘤細胞的抑制作用存在差異,MCTF抗腫瘤作用具有一定的選擇性和敏感性。

2.3 MCTF對SiHa細胞形態的影響

用倒置顯微鏡觀察各實驗組細胞形態, 結果如圖 1 所示。

從圖1可以看出,與正常對照組比較,不同濃度的MCTF給藥組細胞形態發生改變,低劑量組(25 μg·mL-1)細胞形態接近正常對照組,但細胞密度低于正常對照組,且隨著MCTF濃度的增加,細胞密度顯著降低,細胞逐漸變亮、變圓,并出現破裂、空泡、聚團、碎片等現象。

圖1 MCTF對SiHa細胞形態的影響Fig.1 Effect of MCTF on morphology of SiHa cells

2.4 MCTF對SiHa細胞周期分布的影響

利用低、中劑量(25 μg·mL-1、50 μg·mL-1,下同)的MCTF干預 SiHa細胞 24 h 后,通過流式細胞術檢測細胞周期,結果如圖2和表3所示。

a.正常對照組 b.25 μg·mL-1MCTF c.50 μg·mL-1MCTF

表3 MCTF對SiHa細胞周期分布的影響Tab.3 Effect of MCTF on cycle distribution of SiHa cells

從圖2、表3可以看出,相較于正常對照組,低、中劑量組細胞G0/G1期分布比例下降,S期、G2/M期分布比例上升,且具有極顯著性差異(P<0.01),說明MCTF使SiHa細胞阻滯在G0/G1期,阻斷細胞的DNA合成,停止細胞分裂,抑制細胞增殖。

2.5 MCTF對SiHa細胞凋亡率的影響

利用低、中劑量的MCTF干預SiHa細胞24 h后,考察MCTF 對SiHa細胞凋亡率的影響,結果如圖3和表4所示。

a.正常對照組 b.25 μg·mL-1MCTF c.50 μg·mL-1MCTF

表4 MCTF對SiHa細胞凋亡率的影響Tab.4 Effect of MCTF on apoptosis rate of SiHa cells

從表4可以看出,與正常對照組比較,低、中劑量的MCTF干預SiHa細胞 24 h,對細胞晚期(Q2)影響極顯著,且總凋亡率由5.88%±0.29%分別升至11.57%±0.27%、18.08%±1.63%。表明,低劑量MCTF即可誘導SiHa細胞凋亡。

2.6 討論

洋甘菊提取物中總黃酮含量高達 6%,主要包括柚皮苷元(黃烷酮)、蘆丁(黃酮醇)、木犀草素和木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷(占總黃酮的17%)[11]。Shebbo等[12]研究發現,洋甘菊提取物對二甲肼(DMH)誘導的中期階段結直腸癌小鼠肝臟有保護作用,通過降低AST和ALT水平,調節Wnt信號通路,抑制肝細胞增殖,進而減輕肝損傷。El Joumaa等[13]研究發現,洋甘菊提取物可有效降低DMH誘導的小鼠大腸癌發病率,通過調節Wnt途徑,下調Wnt5-α、β-catenin、T細胞因子(Tcf4)、Cyclin D1水平,降低COX-2 和iNOS活性來抑制腫瘤細胞增殖,而COX-2和iNOS在炎癥實驗模型和腫瘤生長中起著關鍵作用。聯合使用洋甘菊和納米銀(AgNPs)是治療肺癌的一種有效策略,洋甘菊水提物合成的AgNPs對A549細胞具有劑量和時間依賴性的細胞毒作用[14]。研究顯示,洋甘菊提取物對乳腺癌細胞[15](T-47D、MCF-7、MDA-MB-468)、前列腺癌細胞(LNCaP、PC-3、DU145)、結腸癌細胞(RKO)和纖維肉瘤細胞(HT1080)均有不同程度的抑制和促凋亡作用[16]。

本研究以MCTF為藥物基礎,選取7種腫瘤細胞A549、AGS、HeLa、SiHa、Eca-109、TE-1及HepG2,探討MCTF的體外抗腫瘤活性。結果表明,MCTF對7種腫瘤細胞增殖均有一定的抑制作用,其中對SiHa細胞的抑制作用最強。MCTF 干預SiHa細胞后,細胞形態改變,并使細胞周期阻滯在G0/G1期,抑制細胞生長,促進細胞凋亡。但本研究對MCTF抑制SiHa細胞是初步研究,后期需進一步通過細胞相關表征(遷移、侵襲)及相關的蛋白實驗數據來支撐;關于MCTF抑制SiHa細胞的具體機制,可以基于蛋白組學、代謝組學、生物信息技術尋找相關的靶蛋白及對應的通路進行深入分析。

3 結論

采用CCK-8法研究了MCTF對人肺癌細胞A549、人胃癌細胞AGS、人宮頸癌細胞HeLa及SiHa、人食管癌細胞Eca-109及TE-1、人肝癌細胞HepG2體外增殖的抑制作用,并采用流式細胞術檢測了MCTF對SiHa細胞周期分布及凋亡率的影響。結果表明,與空白對照組比較,MCTF對7種腫瘤細胞增殖均有不同程度的抑制作用,其中對SiHa細胞的抑制作用最強,作用48 h的IC50值為(97.74±4.02) μg·mL-1;低、中劑量組(25 μg·mL-1、50 μg·mL-1)干預SiHa細胞24 h后,細胞阻滯在G0/G1期,總凋亡率由5.88%±0.29%分別升至11.57%±0.27%、18.08%±1.63%,說明低劑量洋甘菊總黃酮可抑制SiHa細胞增殖,誘導SiHa細胞凋亡。為后期MCTF抑制SiHa細胞的作用機制研究奠定了基礎。