纖維素酶的研究與應(yīng)用進(jìn)展

趙 鑫,張 紅,門中華,馬 勇,溫 彤

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭師范學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014030)

纖維素作為環(huán)境中含量極為豐富的可再生有機(jī)物,是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要物質(zhì)[1]。有數(shù)據(jù)顯示,全球植物每年生成的干物質(zhì)高達(dá)1 500億t,其中纖維素和半纖維素的總量約850億t[2]。近年來,隨著環(huán)境問題的日益凸顯及化石燃料存儲量的逐漸下降,人們對新能源的需求不斷增加,可再生資源受到越來越多的關(guān)注。作為自然界中最豐富的可再生有機(jī)物,纖維素的轉(zhuǎn)化利用對于解決環(huán)境污染、能源危機(jī)等具有十分重要的意義。纖維素酶作為一種高活性的生物催化劑,具有纖維素降解能力,且降解條件溫和、高效,在纖維素的轉(zhuǎn)化利用中具有廣泛的應(yīng)用價值。目前,研究人員主要通過選育自然環(huán)境中纖維素酶高產(chǎn)菌、優(yōu)化發(fā)酵條件、對微生物和纖維素酶進(jìn)行生物學(xué)改造等手段提高纖維素的利用率。在此,作者在介紹纖維素及纖維素酶的基礎(chǔ)上,對纖維素酶的研究進(jìn)展及其在紡織、造紙、飼料、食品及能源等行業(yè)的應(yīng)用進(jìn)行綜述,以期為纖維素酶的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 纖維素概述

1.1 纖維素的結(jié)構(gòu)與功能

1.1.1 纖維素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

纖維素是一類由葡萄糖單元通過β-1,4糖苷鍵連接成的線性聚合物。天然纖維素主要由植物體合成,是自然界中分布最廣、含量最多的可再生有機(jī)物,其含有的生物炭占自然界總量的一半以上[3]。在植物細(xì)胞壁中,纖維素分子之間通過共價鍵和非共價鍵緊緊連接,形成較為致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。纖維素、半纖維素及木質(zhì)素相互結(jié)合形成了復(fù)雜的超分子化合物,進(jìn)而形成了極為堅(jiān)固的植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[4]。在對這類結(jié)構(gòu)的研究中,二相體理論[5]得到了目前為止最為廣泛的認(rèn)可。該理論認(rèn)為,細(xì)胞壁中纖維素主要以兩種形式排列:一種是由直鏈的大分子纖維素整齊排列、折疊而成的結(jié)構(gòu)致密的結(jié)晶區(qū);另一種則是由纖維素分子通過不規(guī)則排列形成的無定形區(qū)[6-8]。

1.1.2 纖維素的生物學(xué)功能

纖維素作為陸生植物的骨架材料,經(jīng)過長達(dá)數(shù)十億年的進(jìn)化,具有極強(qiáng)的維持細(xì)胞形態(tài)和保護(hù)細(xì)胞的功能,其生物學(xué)功能主要體現(xiàn)在能夠提高細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度,從而保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷以及滲透壓等外力的破壞;另外,纖維素作為細(xì)胞壁的主要骨架,承受著內(nèi)部由于液泡吸水膨脹而產(chǎn)生的擴(kuò)張力,從而使植物細(xì)胞及器官具有固定的形態(tài)。此外,由于纖維素的單體結(jié)構(gòu)為葡萄糖,其也是重要的生物碳源和能量來源;但由于其結(jié)構(gòu)致密穩(wěn)定,因此在自然界中難以被降解和廣泛利用[9]。

1.2 纖維素的降解利用

在自然界中,能夠降解并利用纖維素作為碳源和能源的生物主要包括部分細(xì)菌、真菌及原生動物等,其利用方式多為:纖維素分子經(jīng)不同類別的葡聚糖水解酶協(xié)同作用,降解為單糖或小分子寡糖,隨后被進(jìn)一步分解利用。另外,隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平的不斷提高,以秸稈、谷殼等為代表的富含纖維素的殘余物數(shù)量也急劇增加。為了有效處理和利用這類農(nóng)產(chǎn)品殘余物,纖維素高效降解技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用逐漸成為研究熱點(diǎn)。目前,纖維素的降解方法主要有物理降解法、化學(xué)降解法及生物降解法[10]。

1.2.1 物理降解法

物理降解法主要是通過對纖維素類物質(zhì)進(jìn)行破碎處理,大幅降低細(xì)胞壁中纖維素的結(jié)晶度,同時增強(qiáng)破碎后小分子組分的溶解能力,從而改變細(xì)胞壁特有的緊密穩(wěn)定結(jié)構(gòu),達(dá)到降解纖維素的目的[11]。目前,常用的纖維素物理降解法包括微波處理法、冷凍粉碎法、機(jī)械破碎微粒法等,普遍存在操作復(fù)雜、能耗大、成本高等缺點(diǎn)。纖維素進(jìn)行物理降解前通常需進(jìn)行酸堿浸泡等預(yù)處理,不僅延長了降解周期,且易造成二次污染。因此,纖維素的物理降解法在實(shí)際應(yīng)用時受到較大限制[12]。

1.2.2 化學(xué)降解法

化學(xué)降解法是通過化學(xué)試劑將半纖維素、纖維素及木質(zhì)素等大分子溶解,在降低結(jié)晶度的同時提高其溶解度,從而達(dá)到降解的目的。目前,常用的纖維素化學(xué)降解法包括堿水解法、酸水解法、有機(jī)溶劑法等[13]。與物理降解法相比,化學(xué)降解法操作簡單,但存在相似的弊端,即降解產(chǎn)物及設(shè)備均需進(jìn)行復(fù)雜的后處理以避免酸堿污染。

1.2.3 生物降解法

生物降解法是指在特定條件下,纖維素被微生物完全分解為小分子化合物的過程。與物理降解法及化學(xué)降解法相比,生物降解法具有成本低、無污染、條件溫和、操作簡單、對儀器設(shè)備要求低等特點(diǎn),且生物降解法可破壞纖維素、半纖維素、木質(zhì)素這3種分子之間的緊密結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)徹底降解。基于以上優(yōu)勢,纖維素的生物降解法逐步占據(jù)主導(dǎo)地位[14]。

微生物對纖維素的降解主要通過不同葡聚糖水解酶的協(xié)同作用完成。目前,研究人員針對纖維素在機(jī)體中的降解過程開展了大量研究,提出了眾多假說,其中C1-Cx假說、順序假說、協(xié)同作用假說、短纖維形成假說具有廣泛認(rèn)可度和較高權(quán)威性。

1950年,Reese[15]首次提出了C1-Cx假說,該假說認(rèn)為外切葡聚糖酶(C1)、內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)及β-葡萄糖苷酶(BG)是按照固定步驟對纖維素進(jìn)行降解,即首先纖維素的結(jié)晶區(qū)被C1酶結(jié)合并斷開,然后由Cx酶水解大分子多糖生成纖維二糖及其它小分子,最后由BG酶作用于纖維二糖的糖苷鍵,生成小分子葡萄糖。

1987年,Enari等[16]提出的順序假說與C1-Cx假說相反,該假說認(rèn)為首先Cx酶作用于纖維素的結(jié)晶區(qū),再由C1酶進(jìn)攻大分子多糖生成纖維二糖或其它小分子,最后BG酶降解纖維二糖生成小分子葡萄糖。

協(xié)同作用假說是目前大多認(rèn)可的纖維素降解理論,該假說認(rèn)為纖維素酶組分之間存在類似于C1-Cx假說、順序假說的協(xié)同作用,且C1酶、Cx酶及BG酶的組成比例對纖維素的降解具有決定性作用[17-18]。

短纖維形成假說認(rèn)為,首先解鏈因子或解氫鍵酶作用于天然纖維素上,破壞纖維素鏈的氫鍵,纖維素長鏈變成短鏈,再通過C1酶、 Cx酶及BG酶的協(xié)同作用生成小分子葡萄糖。

2 纖維素酶概述

2.1 自然界中纖維素酶的微生物來源

2.1.1 原核纖維素降解微生物

原核纖維素降解微生物主要來源于細(xì)菌及放線菌。其中細(xì)菌的主要來源菌屬為纖維粘菌屬、芽孢桿菌屬、熱雙歧菌屬和歐文氏菌屬等[19],細(xì)菌分泌的是單一酶,通常為內(nèi)切纖維素酶,應(yīng)用pH值范圍為中性和堿性,酶活低,產(chǎn)量低,提純難度高,且多為胞內(nèi)酶[20]。放線菌的主要來源菌屬為纖維放線菌屬、諾卡氏菌屬和鏈霉菌屬,其分泌酶的應(yīng)用pH值范圍較廣,且在高溫環(huán)境中也具有較高的活性,編碼酶的基因較為簡單,更容易進(jìn)行基因重組與改造,但其菌株生長速度較慢且酶產(chǎn)量較低,因此,針對放線菌的研究較少[21]。

2.1.2 真核纖維素降解微生物

真核纖維素降解微生物主要來源菌屬為木霉屬、曲霉屬和青霉屬等,其分泌的是復(fù)合酶,相比于原核纖維素降解微生物,酶活較高,產(chǎn)量較高,且為胞外酶,易于提取,但其應(yīng)用pH值范圍通常為酸性,只能應(yīng)用于酸性條件下的工業(yè)生產(chǎn)[22-24]。

原生生物通常會出現(xiàn)在宿主后腸中,與其它微生物共同作用降解宿主體內(nèi)的纖維素,這些宿主包括線蟲、鰲蝦、福壽螺、白蟻、天牛等[25],單一物種的原生生物產(chǎn)生的纖維素酶通常為單功能酶。因此,雖然不同種類原生生物對纖維素的降解機(jī)制不盡相同,但其對纖維素的降解均需要多種單功能酶的協(xié)同作用。

2.2 纖維素酶的類別與功能

纖維素酶是由內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等具有單一功能的酶組成的復(fù)合酶。纖維素在這3種酶的協(xié)同作用下,被降解成小分子葡萄糖,其過程如圖1a所示[26]。

圖1 纖維素酶組分協(xié)同降解纖維素(a)及內(nèi)切葡聚糖酶(b)、外切葡聚糖酶(c)、β-葡萄糖苷酶(d)的作用機(jī)制Fig.1 Action mechanism of synergistic degradation of cellulose by cellulase components(a),endoglucanase(b),exoglucanase(c),and β-glucosidase(d)

2.2.1 內(nèi)切葡聚糖酶

內(nèi)切葡聚糖酶或內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4),也稱作CMC酶、Cx酶,簡稱EG(真菌)和Cen(細(xì)菌)。內(nèi)切葡聚糖酶隨機(jī)地切割纖維素多糖鏈中無定形區(qū),生成長度不一的寡糖,包括纖維二糖、纖維三糖及纖維糊精等,這些寡糖成為新的鏈端,為下一步降解作好鋪墊[17](圖1b)。

2.2.2 外切葡聚糖酶

外切葡聚糖酶分為2種酶:一種是β-1,4-D-葡聚糖-纖維二糖水解酶;另一種是β-1,4-D-葡聚糖-葡萄糖水解酶(EC 3.2.1.74),簡稱CBH(真菌)和Cex(細(xì)菌)。外切葡聚糖酶主要切割位點(diǎn)為纖維素長鏈的還原末端或非還原末端,產(chǎn)生不同的寡糖,包括纖維二糖及葡萄糖等小分子(圖1c)。

根據(jù)識別位點(diǎn),外切葡聚糖酶又可分為CBH Ⅰ和CBH Ⅱ兩類[27],其中前者的作用位置是纖維素的還原末端,而后者的作用位置是非還原末端。如里氏木霉(Trichodermareesei)可以表達(dá)還原性外切葡聚糖酶TrCel7A[28],還可以表達(dá)非還原性內(nèi)切葡聚糖酶TrCel6A[29];Phanerochaetechrysosporium可以表達(dá)還原性內(nèi)切葡聚糖酶PcCel7D[30]。

2.2.3 β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶或β-1,4-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21),簡稱BG。β-葡萄糖苷酶將纖維二糖(其它短鏈的纖維寡糖)或纖維糊精水解成小分子葡萄糖[19,31](圖1d)。

2.3 纖維素酶的結(jié)構(gòu)

大量研究表明,細(xì)菌與真菌體內(nèi)均含有纖維素酶且結(jié)構(gòu)相似[32]。較為典型的纖維素酶通常是由結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)域(cellulose binding domain,CBD)、催化結(jié)構(gòu)區(qū)域(catalytic domain,CD)和連接結(jié)構(gòu)區(qū)域(linker)等3部分組成[33],另外部分纖維素酶分子結(jié)構(gòu)中含有其它特殊催化結(jié)構(gòu)。

2.3.1 結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)域

結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)域呈楔形的尾巴結(jié)構(gòu),在纖維素酶催化纖維素降解過程中行使識別催化位點(diǎn)的作用,并將纖維素酶分子與纖維素特異性連接到一起。在纖維素酶分子催化降解纖維素的整個過程中,結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)域雖然不起催化作用,卻是整個催化過程開始的關(guān)鍵一步。研究[34]表明,結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)域不會影響纖維素酶的活性,各類纖維素酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)域在纖維素催化降解中的作用機(jī)制類似。

2.3.2 催化結(jié)構(gòu)區(qū)域

催化結(jié)構(gòu)區(qū)域呈球形結(jié)構(gòu),在纖維素降解過程中主要負(fù)責(zé)催化β-1,4糖苷鍵斷裂。外切葡聚糖酶與內(nèi)切葡聚糖酶的催化結(jié)構(gòu)區(qū)域的活性位點(diǎn)不同、催化機(jī)理也有所不同[35]。其中,前者活性位點(diǎn)在長圓形管道中,可水解不溶于水的纖維素結(jié)構(gòu),解離長鏈分子,在與還原末端作用時能達(dá)到更好的催化作用;后者活性位點(diǎn)在向外開口處,該開口可與非結(jié)晶纖維相結(jié)合[36]。

2.3.3 連接結(jié)構(gòu)區(qū)域

連接結(jié)構(gòu)區(qū)域是一段高度糖基化多肽鏈,用于連接結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)域與催化結(jié)構(gòu)區(qū)域,其中高度糖基化可以抵御其它酶的水解,從而確保該結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,保證結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)域與催化結(jié)構(gòu)區(qū)域的距離,使不同酶形成相對穩(wěn)定的聚集物。

3 纖維素酶的研究進(jìn)展

3.1 纖維素酶的篩選

有數(shù)據(jù)顯示,自然界中微生物的物種數(shù)量有一萬億種,其中可以實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的物種不足1%[37]。為了獲得性能優(yōu)異的纖維素酶,篩選優(yōu)良菌株是最直接、最有效的方法。篩選優(yōu)良菌株的途徑很多,例如土壤、水體及動物腸道、糞便等[38]。目前,從豬糞便[39]、魚類腸道[40]、白蟻腸道[41]以及土壤[42]中均成功分離獲得了纖維素酶,Rathore等[43]在水葫蘆湖區(qū)的水源中篩選出產(chǎn)纖維素酶菌。此外,在部分極端環(huán)境中也存在產(chǎn)纖維素酶菌,且具有獨(dú)特的性質(zhì)。Priya等[44]從喜馬拉雅山西北部的塔塔帕尼溫泉的沉積物中分離出 8 株產(chǎn)纖維素酶的嗜熱菌。

雖然目前篩選分離出大量具有產(chǎn)纖維素酶能力的微生物,但所產(chǎn)纖維素酶依然存在降解效率低、酶活性低及受水解底物抑制等問題。因此,纖維素酶高產(chǎn)菌株的選育與發(fā)酵條件的優(yōu)化是有效提高纖維素降解效率的重要途徑。

3.2 纖維素酶高產(chǎn)菌株的選育

3.2.1 纖維素酶高產(chǎn)菌株的誘變育種

目前,最直接、最有效的選育纖維素酶高產(chǎn)菌株的方法為誘變育種[45-46]。

3.2.1.1 物理誘變育種

物理誘變育種主要包括紫外線、X-射線、微波、快中子、γ-射線及重離子束輻照等。Raghuwanshi等[47]通過紫外線對棘孢木霉RCK2011進(jìn)行誘變處理,篩選獲得的突變菌株 SR1-7的濾紙酶活最高達(dá)到2.2 U·g-1;突變菌株產(chǎn)生的纖維素酶培養(yǎng)液對麥草、玉米芯和甘蔗渣等生物質(zhì)的降解效率顯著提高。Li等[48]通過紫外線與微波聯(lián)合誘變處理1株綠色木霉,獲得了 M-B1、M-B2、M-B3、M-B4、M-B5、M-B6、M-B7 等7 株優(yōu)良突變菌株,其酶活比誘變前顯著提高。

重離子束輻照是一種較為先進(jìn)的物理誘變育種法,因具有DNA 損傷后難以正確修復(fù)、傳能線密度高、相對生物學(xué)效應(yīng)高及突變譜廣等特性,在菌種選育中具有獨(dú)特的優(yōu)勢,受到越來越多研究者的關(guān)注[49-50]。Dong等[51]利用重離子束輻照對野生型煙曲霉菌株進(jìn)行誘變處理,篩選獲得了酶活較高的突變株MS160.53,其FPA和CMC酶活分別達(dá)到1.81 U·mL-1和1.11 U·mL-1,其對堿預(yù)處理秸稈的還原糖含量達(dá)到789.75 mg·(g秸稈)-1。Wang等[52]利用重離子束輻照誘變處理綠色木霉,獲得1株高產(chǎn)菌株,其液體發(fā)酵液中濾紙酶活最高達(dá)到688.99 U·mL-1,較誘變前提高了約71.29%。

3.2.1.2 化學(xué)誘變育種

化學(xué)誘變育種主要是通過使用化學(xué)誘變劑(如亞硝基胍、甲基磺酸乙酯、亞硝酸鹽等)來改變微生物的遺傳物質(zhì),從而達(dá)到誘變育種的目的。Gadgil等[53]利用紫外線與亞硝酸鈉對里氏木霉QM9414進(jìn)行復(fù)合誘變處理,篩選獲得了1株纖維素酶高產(chǎn)突變菌株,其發(fā)酵液中濾紙酶活最高達(dá)到0.54 U·mL-1;同時,其對纖維素底物的糖化能力是誘變前的1.2倍。Jiang等[54]通過甲基磺酸乙酯化學(xué)誘變與紫外線誘變相結(jié)合的方式對綠色木霉進(jìn)行誘變處理,篩選獲得了1株β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)突變菌株EU2-77,所產(chǎn)纖維素酶對底物的水解能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于誘變前。

3.2.2 纖維素酶的異源表達(dá)

纖維素酶的異源表達(dá)主要是通過人為定向改造纖維素酶合成結(jié)構(gòu)基因或調(diào)控基因?qū)崿F(xiàn)纖維素酶基因在宿主中高效表達(dá)與分泌。異源表達(dá)的一般步驟為:目的基因的克隆、宿主載體的選取、重組菌株的建立、目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)。自20世紀(jì)70年代,纖維素酶的編碼基因開始逐步被克隆并實(shí)現(xiàn)了纖維素酶基因的異源表達(dá)。Fang等[55]將來自外源基因的cbh1強(qiáng)啟動子克隆于里氏木霉菌bgl1 基因的上游以提高該基因的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),改造后菌株的發(fā)酵液中β-葡萄糖苷酶活性顯著提高,同時其纖維素酶蛋白的表達(dá)量顯著增加。Ma等[56]在里氏木霉菌株中通過采用外源基因的cbh1強(qiáng)啟動子表達(dá)了斜臥青霉來源的β-葡萄糖苷酶基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn),改造后菌株的發(fā)酵液中β-葡萄糖苷酶活性提高了6～8倍,濾紙酶活提高了約30%;此外,使用改造菌株的發(fā)酶液進(jìn)行玉米秸稈的糖化實(shí)驗(yàn)時發(fā)現(xiàn),其糖化效率也顯著提高。Wang等[57]在里氏木霉中對來源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行異源表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),改造后菌株的β-葡萄糖苷酶活性顯著提高,與改造前相比提高了106倍,同時其濾紙酶活也提高了44%。

3.3 纖維素酶的發(fā)酵工藝優(yōu)化

對于產(chǎn)纖維素酶微生物來說,碳源是影響其酶產(chǎn)量最重要的因素;纖維素酶作為一種誘導(dǎo)酶[58],其產(chǎn)生過程需要多糖類物質(zhì)的誘導(dǎo)。因此,同時作為碳源和誘導(dǎo)物的多糖類物質(zhì)通常是纖維素酶發(fā)酵工藝優(yōu)化的重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),廢紙[59]、甘蔗渣[60]和生活污水[61]等可用作產(chǎn)纖維素酶微生物的誘導(dǎo)底物。此外,培養(yǎng)條件如發(fā)酵溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、發(fā)酵液pH值等對酶產(chǎn)量同樣重要。其中,發(fā)酵溫度超過一定范圍就會導(dǎo)致微生物喪失細(xì)胞功能甚至死亡[62];攪拌轉(zhuǎn)速對微生物的影響主要體現(xiàn)在供氧和剪切力上,攪拌轉(zhuǎn)速與供氧、剪切力成正比;發(fā)酵液 pH 值通過改變細(xì)胞膜電荷而影響微生物活性[63]。

3.4 纖維素酶的改性

選育纖維素酶高產(chǎn)菌株及優(yōu)化纖維素酶發(fā)酵工藝對提高纖維素酶產(chǎn)量是有限的,無法完全滿足工業(yè)化應(yīng)用。因此,為進(jìn)一步提高纖維素酶活性、穩(wěn)定性以及其它有利于大規(guī)模應(yīng)用的特性,需采用分子修飾對纖維素酶進(jìn)行改造。目前,常用的分子修飾策略包括化學(xué)修飾、定點(diǎn)突變等,其中化學(xué)修飾最常見的方法有接枝可溶性大分子或小分子修飾、交聯(lián)修飾等[64]。

3.4.1 接枝可溶性大分子或小分子修飾

酶的接枝可溶性大分子修飾是將可溶性的大分子修飾劑(如聚乙二醇、葡聚糖等)與酶分子通過共價鍵連接在一起,從而提高酶的活性及穩(wěn)定性,降低酶的抗原性[65]。Park等[66]通過在纖維素酶中引入兩親性共聚物共價偶聯(lián),改變了酶的吸附參數(shù)且提高了酶活。張?jiān)Ｇ涞萚67]利用聚氧乙烯-馬來酸酐聚合物改性纖維素酶,改性后纖維素酶的高溫耐受性顯著提高,且可以有效促進(jìn)盾葉薯蕷薯蕷皂苷向薯蕷皂苷元的轉(zhuǎn)化。

由于纖維素酶分子表面有近一半為非極性基團(tuán),從而導(dǎo)致纖維素酶的穩(wěn)定性較差,為了提高纖維素酶的穩(wěn)定性和活性,可以利用小分子對非極性基團(tuán)進(jìn)行修飾。Bund等[68]在2～4 ℃下將酸性纖維素酶與 0.5 mol·L-1馬來酸酐連接在一起,修飾后的纖維素酶對堿性環(huán)境的耐久度顯著提升。

3.4.2 交聯(lián)修飾

酶的交聯(lián)修飾是將蛋白質(zhì)交聯(lián)劑作用到酶分子內(nèi)或酶分子間使酶分子發(fā)生交聯(lián)。Zheng等[69]采用超細(xì)研磨結(jié)合磷酸鹽交聯(lián)纖維素酶,改善了谷子麩皮膳食纖維的體外降血糖和降血脂性能。Li等[70]通過纖維素酶與硫酸銨沉淀,然后與戊二醛交聯(lián)形成交聯(lián)纖維素酶聚集體,其具有更高的催化活性、更強(qiáng)的適應(yīng)性,且重復(fù)使用次數(shù)大幅增加。

3.4.3 定點(diǎn)突變

酶的定點(diǎn)突變是將氨基酸殘基通過定點(diǎn)突變技術(shù)連接到酶分子上的靶向位置,然后對該氨基酸殘基進(jìn)行一系列修飾,最終得到突變酶。Yang等[71]采用隨機(jī)突變和定點(diǎn)突變相結(jié)合的定向進(jìn)化方法提高CtLac的漆酶活性,篩選得到的菌株V243D在最適條件(70 ℃,pH值8.0)下對木質(zhì)素的氧化降解能力明顯增強(qiáng),且高值醛產(chǎn)量提高了50%～95%。Zhou等[72]對內(nèi)切葡聚糖酶(CgEndo)進(jìn)行異源表達(dá)和定點(diǎn)突變,結(jié)果顯示,突變菌株Y63S和N20D/S113T的酶活分別提高了62.31%和57.14%。

4 纖維素酶的應(yīng)用

纖維素在自然界中分布極為廣泛且含量豐富,纖維素酶可將富含纖維素的工業(yè)廢料和農(nóng)副產(chǎn)品等有效轉(zhuǎn)化,對于提高原料利用率、綜合利用資源等具有重要意義。纖維素酶已廣泛應(yīng)用于紡織、造紙、飼料、食品及能源等行業(yè)。

4.1 紡織行業(yè)

為了解決紡織行業(yè)所存在的環(huán)境污染問題,纖維素酶的應(yīng)用逐漸廣泛。纖維素酶可以分解棉織物上的小纖維,防止絨毛起球。纖維素酶在牛仔紡織物的生物去石、紡織物及服飾軟化、紡織物纖維的生物拋光及紡織物表面染料的去除等方面[73-74]應(yīng)用廣泛。

4.2 造紙行業(yè)

紙漿和紙張作為一種可循環(huán)利用的再生資源,其回收及利用對于節(jié)約能源、減輕環(huán)境污染具有重要意義[75]。脫墨是紙漿處理的重要環(huán)節(jié),利用纖維素酶脫墨不但可以防止紙張變黃,而且避免了堿液的使用。與堿性纖維素酶和中性纖維素酶相比,酸性纖維素酶可以顯著提高紙張的亮度和清潔度,處理效果更好[76-77]。另外,纖維素酶參與紙漿處理,一方面可以有效提高打漿性能,另一方面可以在不改變紙漿強(qiáng)度的前提下顯著改善濾水性能,從而得到較為柔軟的薄紙張[78]。

4.3 飼料行業(yè)

飼料品質(zhì)對于禽畜產(chǎn)品品質(zhì)具有決定性作用。由于反芻動物的反芻胃中含有能夠分泌纖維素酶的微生物且酶活性很高,因此,反芻動物對于富含纖維素的飼料具有一定的消化吸收能力,但其對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率有限[79]。內(nèi)切葡聚糖酶作為一種飼料添加劑,其主要通過作用纖維素類飼料的細(xì)胞壁,使纖維素結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,將難以降解的纖維素分子降解為短鏈寡糖,從而使其營養(yǎng)物質(zhì)更易被動物消化系統(tǒng)分解吸收,提高飼料的營養(yǎng)價值[80];研究證實(shí),纖維素經(jīng)內(nèi)切葡聚糖酶降解后形成的部分寡糖具有類似益生元的功能,即這類物質(zhì)可以被腸道的有益菌選擇性地降解并加以利用,而不能被動物后腸的有害菌降解利用,因而具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力及提高生育能力等作用[81-82]。

4.4 食品行業(yè)

纖維素酶在食品行業(yè)的應(yīng)用極其廣泛。例如在啤酒生產(chǎn)中,纖維素酶可以增強(qiáng)過濾性能,提高啤酒產(chǎn)率及品質(zhì)[83];在白酒生產(chǎn)中,纖維素酶可以降解原料中的大量纖維素,最終形成小分子葡萄糖,為酵母對原料的分解利用提供了便利,進(jìn)而提升原料中纖維素的利用率及出酒率;在葡萄酒釀造過程中,添加纖維素酶可以提升葡萄酒香味,從而改善葡萄酒品質(zhì)[84];在醬油釀造過程中,添加纖維素酶不但可以加快發(fā)酵速度,而且可以改善醬油風(fēng)味和品質(zhì);在茶葉加工過程中,添加纖維素酶可加快茶多糖的釋放,從而提高茶多酚含量。

4.5 能源行業(yè)

我國作為農(nóng)業(yè)大國,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的大量富含纖維素的農(nóng)業(yè)廢棄物處置不當(dāng)不僅加劇環(huán)境污染,而且造成資源浪費(fèi)。纖維素酶可以將農(nóng)業(yè)廢棄物中的纖維素轉(zhuǎn)化為寡糖甚至是葡萄糖,這些寡糖可經(jīng)過發(fā)酵生產(chǎn)乙醇類產(chǎn)品[85]。另外,在石油開采中,由纖維素酶制成的破乳劑具有零污染、專一性強(qiáng)、沒有任何副作用等優(yōu)點(diǎn)[86-87]。

5 展望

目前,利用纖維素酶對纖維素或富含纖維素原料進(jìn)行降解或改性已廣泛應(yīng)用于紡織、造紙、飼料、食品及能源等行業(yè)。但作為蛋白質(zhì),纖維素酶存在穩(wěn)定性低、耐極端溫度和pH值能力差、生產(chǎn)成本高等問題,限制了其應(yīng)用范圍。因此,通過天然纖維素酶篩選、產(chǎn)纖維素菌種改造、發(fā)酵條件優(yōu)化和酶分子改性等手段提高纖維素酶的性能和產(chǎn)量,降低其生產(chǎn)成本一直是研究熱點(diǎn)。