不同抗性甘藍(lán)品種對(duì)黑腐病的生理響應(yīng)

張?chǎng)析?/p>

（山西運(yùn)城農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 運(yùn)城 044000）

結(jié)球甘藍(lán)簡(jiǎn)稱(chēng)甘藍(lán)，是一種十字花科蕓薹屬蔬菜作物，栽培歷史悠久，在世界各地廣泛栽培［1］。隨著甘藍(lán)在世界各地的普遍推廣，復(fù)種指數(shù)居高以及重茬嚴(yán)重，各種病害相繼出現(xiàn)，由野油菜黃單胞菌引起的黑腐病為其中一種主要病害［2］。

甘藍(lán)黑腐病常發(fā)生于溫暖、潮濕的氣候條件下［3］。近年來(lái)，甘藍(lán)黑腐病在我國(guó)蔬菜生產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，病征表現(xiàn)為：初期，葉片邊緣出現(xiàn)黃褐色V 形病斑。隨著病原菌在植株體內(nèi)蔓延，出現(xiàn)維管束變黑、植株枯死的情況，且常伴隨軟腐病的發(fā)生，嚴(yán)重影響甘藍(lán)的產(chǎn)量和質(zhì)量［4-9］。

國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，小麥、花椰菜、大豆、煙草、花生、菜豆、水稻、黃瓜、大白菜等多種植物感染病原菌后，葉片和根系的生理生化活動(dòng)會(huì)發(fā)生一些獨(dú)特的變化，這些變化與植物的抗病性相關(guān)［10-12］。但是，目前關(guān)于結(jié)球甘藍(lán)感染黑腐病菌后葉片及根系發(fā)生的生理生化反應(yīng)的研究報(bào)道較少。因此，本研究選用5 個(gè)抗性不同的甘藍(lán)材料，分別比較結(jié)球甘藍(lán)在感染黑腐病菌后根系以及葉片生理生化指標(biāo)的變化與品種抗病性的關(guān)系，旨在為深入研究結(jié)球甘藍(lán)對(duì)黑腐病的抗病機(jī)理和加快抗病品種選育工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

菌株由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院甘藍(lán)抗病育種研究室提供，編號(hào)YU，致病力較強(qiáng)［13］，該菌株分離自陜西省榆林市田間自然發(fā)病的甘藍(lán)病葉。

1.1.2 供試甘藍(lán)材料

選擇田間抗甘藍(lán)黑腐病差異顯著的5 個(gè)品種：高抗材料QK2502（HR）、抗病材料QG70（R）、中抗材料LQ66（MR）、感病材料QG50（S）、高感材料B02（HS）雜種一代種子，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院甘藍(lán)抗病育種研究室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 幼苗培養(yǎng)

試驗(yàn)在西北農(nóng)林科技大學(xué)科研溫室進(jìn)行。挑選供試甘藍(lán)種子，選擇籽粒飽滿(mǎn)、整齊一致的種子，先在75%酒精中處理1 min，再用滅菌蒸餾水沖洗2～3 次，在25 ℃催芽箱中催芽2 d，選取發(fā)芽一致的種子播種于50 孔穴盤(pán)滅菌基質(zhì)中，播種后的育苗盤(pán)置于溫室中正常管理。

1.2.2 黑腐病菌懸浮液制備

菌株YU 在接種前18 h 轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，搖床28 ℃、190 r/min 培養(yǎng)18 h，再用無(wú)菌水調(diào)節(jié)菌液濃度至1×108cfu/mL。

1.2.3 接種

待供試材料長(zhǎng)至3 葉1 心期進(jìn)行接種。接種前24 h 將材料澆透并覆蓋塑料薄膜保濕，第2 天用小型噴霧器將菌液均勻噴灑到植株葉片上，以葉片無(wú)液滴滴落為度。噴施無(wú)菌水作為空白對(duì)照。每個(gè)處理20 株苗，設(shè)置3 次重復(fù)。接種后繼續(xù)用塑料薄膜保濕36 h，后揭去塑料薄膜，將幼苗放在溫度26、19 ℃，濕度90%條件下正常管理，光照時(shí)長(zhǎng)14 h［14］。

1.2.4 取樣

從接種當(dāng)天起，分別于0、1、3、5、7 d 的固定時(shí)間對(duì)甘藍(lán)幼苗葉片進(jìn)行取樣，取樣后將樣品保存于－80 ℃冰箱中備用，其中，地下部相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定取樣時(shí)間是1、7 d。

1.2.5 測(cè)定項(xiàng)目和采用方法

甘藍(lán)材料根系相關(guān)指標(biāo)：根長(zhǎng)，采用直接測(cè)量法；根系鮮重，采用直接稱(chēng)量法；根系活力，采用TTC 法［15］。

甘藍(lán)材料葉片相關(guān)指標(biāo)：過(guò)氧化物酶（POD）活性，采用愈創(chuàng)木酚氧化法［16］；超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用NBT 光還原法［17］；苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性，采用王敬文和薛應(yīng)龍（1981）［18］的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各處理重復(fù)3 次，結(jié)果計(jì)算平均值，然后采用Microsoft Office Excel 2010 和SPSS 17.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan’s 多重比較分析差異顯著性。

2 結(jié)果分析

2.1 接種黑腐病菌對(duì)不同抗性甘藍(lán)材料根系的影響

由表1 可知，與未接種黑腐病菌的5 個(gè)甘藍(lán)材料幼苗相比，在接種后第1 天，接種幼苗根長(zhǎng)和根系鮮重變化均較小，均未達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；QG70（R）幼苗根系活力表現(xiàn)出顯著升高。在接種后第7 天，經(jīng)接種后5 個(gè)材料的根長(zhǎng)、根系鮮重均不同程度低于未接種材料，其中QG50（S）、B02（HS）經(jīng)過(guò)接種的幼苗根長(zhǎng)明顯低于未接種幼苗，并且差異可達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），QG70（R）、QG50（S）和B02（HS）經(jīng)接種處理的幼苗根系鮮重顯著低于未接種幼苗；接種的QK2502（HR）、QG70（R）、LQ66（MR）、QG50（S）的根系活力均高于未接種幼苗，B02（HS）的根系活力低于未接種幼苗，其中QK2502（HR）經(jīng)過(guò)接種的幼苗根系活力增加率為21.04%，與未接種幼苗差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），LQ66（MR）經(jīng)過(guò)接種的幼苗根系活力顯著高于未接種幼苗，增加率為15.27%。

表1 接種黑腐病菌對(duì)甘藍(lán)幼苗根系的影響

比較5 個(gè)甘藍(lán)材料可知，在第7 天，接種比未接種增加率表現(xiàn)為：根長(zhǎng)增加率由低到高依次為B02（HS）、QG50（S）、QK2502（HR）、LQ66（MR）、QG70（R）；根系鮮重增加率由低到高依次為B02（HS）、QG50（S）、QG70（R）、LQ66（MR）、QK2502（HR）；根系活力增加率由低到高為B02（HS）、QG50（S）、QG70（R）、LQ66（MR）、QK2502（HR），其中B02（HS）根系活力增加率為負(fù)值。圖1 為5 個(gè)甘藍(lán)材料接種黑腐病菌和未接種幼苗第1 天和第7 天根系形態(tài)對(duì)比情況。

圖1 黑腐病菌對(duì)甘藍(lán)幼苗根系的影響（第1天和第7天）

2.2 接種黑腐病菌對(duì)不同抗性甘藍(lán)材料葉片POD活性的影響

由表2 可知，接種黑腐病菌后，5 個(gè)材料幼苗葉片POD 活性均不同程度增加，增加率表現(xiàn)出先升高（第1、3、5 天）后降低（第7 天）的趨勢(shì)。QK2502（HR）在接種后1、3、5、7 d 葉片POD 活性均高于未接種幼苗，且達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），增加率分別為29.77%、35.80%、38.83%、33.79%。QG70（R）在接種后1、5、7 d 葉片POD 活性均高于未接種幼苗，且達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；在接種后3 d 葉片POD 活性顯著高于未接種幼苗，未達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。LQ66（MR）在接種后1 d 葉片POD 活性雖高于對(duì)照，但未達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；在接種后3、5、7 d 葉片POD 活性均極顯著高于未接種幼苗，增加率分別為17.70%、21.06%、16.21%。QG50（S）在接種后5 d 葉片POD 活性極顯著高于未接種幼苗，增加率達(dá)18.65%。B02（HS）在接種后5、7 d 葉片POD 活性極顯著高于未接種幼苗，增加率分別為15.35%、7.71%。

表2 接種黑腐病菌對(duì)葉片過(guò)氧化物酶（POD）活性的影響

比較5 個(gè)甘藍(lán)材料可知，接種比未接種幼苗葉片POD 活性增加率表現(xiàn)為：第1 天增加率由高到低依次為QK2502（HR）、QG70（R）、QG50（S）、LQ66（MR）、B02（HS）；第3、5、7 天增加率由高到低為QK2502（HR）、QG70（R）、LQ66（MR）、QG50（S）、B02（HS）。

2.3 接種黑腐病菌對(duì)不同抗性甘藍(lán)材料葉片SOD活性的影響

由表3 可知，QK2502（HR）、QG70（R）、LQ66（MR）、B02（HS）在接種后幼苗葉片SOD 活性增加率表現(xiàn)出先升高（1、3 d）后降低（5 d）再升高（7 d）的趨勢(shì)，QG50（S）表現(xiàn)出先升高（1 d）后降低（3、5、7 d）的趨勢(shì)。QK2502（HR）接種后1、3、7 d 葉片SOD 活性均高于未接種幼苗，且達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），增加率分別為4.43%、4.48%、10.51%。QG70（R）接種后3、7 d 葉片SOD 活性均極顯著高于未接種幼苗，增加率分別為4.58%、3.09%。LQ66（MR）和B02（HS）接種后幼苗葉片SOD 活性與未接種幼苗相比均有差異，但未達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。QG50（S）接種后3、5、7 d 葉片SOD 活性均顯著低于未接種幼苗，增加率分別為－5.14%、－10.99%、－12.58%。

表3 接種黑腐病菌對(duì)葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

比較5 個(gè)甘藍(lán)材料可知，接種比未接種幼苗葉片SOD 活性增加率表現(xiàn)為：第1 天增加率由高到低依次為B02（HS）、QK2502（HR）、QG50（S）、LQ66（MR）、QG70（R）；第3 天增加率由高到低依次為QG70（R）、QK2502（HR）、LQ66（MR）、B02（HS）、QG50（S）；第5 天增加率由高到低依次為QK2502（HR）、QG70（R）、B02（HS）、LQ66（MR）、QG50（S）；第7 天增加率由高到低依次為QK2502（HR）、QG70（R）、LQ66（MR）、B02（HS）、QG50（S）。

2.4 接種黑腐病菌對(duì)不同抗性甘藍(lán)材料葉片PAL活性的影響

由表4 可知，接種黑腐病菌后，5 個(gè)材料幼苗葉片PAL 活性表現(xiàn)出不同變化，增加率表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)。QK2502（HR）在接種后1、3、5、7 d 葉片PAL 活性均高于未接種幼苗，且達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），增加率分別為12.48%、12.09%、9.43%、6.12%。QG70（R）在接種后1、3 d 葉片PAL 活性均極顯著高于未接種幼苗，增加率分別為9.40%、6.11%；接種后5、7 d 葉片PAL 活性均高于未接種幼苗，但未達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。LQ66（MR）在接種后1、3 d 葉片PAL 活性均高于未接種幼苗，且達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），增加率分別為6.06%、4.38%；接種后7 d 葉片PAL 活性顯著低于未接種幼苗，增加率為－4.50%。QG50（S）在接種后1 d 葉片PAL 活性極顯著高于未接種幼苗；接種后3、7 d葉片PAL 活性均低于未接種幼苗，且達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。B02（HS）在接種后1 d 葉片PAL 活性高于未接種幼苗，但差異不顯著（P＜0.05）；接種后3、5、7 d 葉片PAL 活性均顯著低于未接種幼苗，且第3、7 天差異均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

表4 接種黑腐病菌對(duì)葉片苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響

比較5 個(gè)甘藍(lán)材料可知，在接種后1、3、5、7 d，接種比未接種幼苗葉片PAL 活性增加率由高到低為QK2502（HR）、QG70（R）、LQ66（MR）、QG50（S）、B02（HS）。

3 討論與結(jié)論

根系生長(zhǎng)狀況對(duì)植物生長(zhǎng)起直接作用，關(guān)于抗病性和根系生理生化情況變化之間的關(guān)系已有學(xué)者作了大量研究。邵金旺等（2001）［19］研究甜菜叢根病不同抗性品種根系活力發(fā)現(xiàn)，抗病品種的根系活力明顯高于感病品種。吳曉麗等（2011）對(duì)接種黑腐病菌后花椰菜根系的形態(tài)和生理變化進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，接種處理的植株根長(zhǎng)、根干重明顯比未接種的植株（CK）低，但是接種幼苗的根系活力比未接種幼苗的根系活力高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，接種黑腐病菌的幼苗根長(zhǎng)和根系鮮重明顯低于未接種幼苗，且抗病品種的根長(zhǎng)和根系鮮重降低率低于感病品種；而根系活力則相反，經(jīng)過(guò)接種的幼苗根系活力高于未接種幼苗，且抗病品種的根系活力增加率高于感病品種。這可能是由于黑腐病菌侵染植株，根系生長(zhǎng)受到抑制，導(dǎo)致根長(zhǎng)和根系鮮重小于未接種植株，抗病品種的防御能力較感病品種強(qiáng)，故抗病品種的根長(zhǎng)和根系鮮重降幅小于感病品種；病原菌侵染，植物會(huì)啟動(dòng)防御機(jī)制，根系也會(huì)發(fā)生一系列保護(hù)性反應(yīng)，植株根系對(duì)于病原菌的防御能力增強(qiáng)，從而出現(xiàn)根系活力升高，且抗病品種根系活力升高幅度高于感病品種的現(xiàn)象。在第7 天，B02（HS）根系活力低于未接種植株，可能是由于此時(shí)植株的保護(hù)機(jī)制已經(jīng)被破壞。

過(guò)氧化物酶（POD）雖無(wú)直接的抗菌活性，但其可以通過(guò)影響植物體內(nèi)的多種代謝途徑而在抗病性中起到間接作用。當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，SOD 是清除活性氧的主要酶之一。苯丙烷類(lèi)代謝途徑是植物在抗病反應(yīng)體系中的一個(gè)重要途徑，而苯丙氨酸解氨酶是該途徑的關(guān)鍵酶和限速酶［20］。已有學(xué)者對(duì)抗病性與POD活性、SOD 活性、PAL 活性的關(guān)系進(jìn)行了研究。吳應(yīng)海等（2022）［21］研究發(fā)現(xiàn)，為百香果接種莖基腐病后，植物體內(nèi)POD 活性、SOD 活性、PAL 活性均有升高，且抗病性越強(qiáng)酶活性越高。黃志磊等（2019）［22］研究表明，不同抗性大麥品種在受到葉斑病菌侵害時(shí)POD 活性、SOD 活性、PAL 活性均升高并且隨著時(shí)間延長(zhǎng)增幅逐漸增加，且抗病品種蒙啤麥3 號(hào)升高幅度均大于感病品種蒙啤麥1 號(hào)。本研究對(duì)QK2502、QG70、LQ66、QG50、B02 這5 個(gè)抗性不同的甘藍(lán)品種接種黑腐病菌后，葉片POD 活性均不同程度增加，其中從第3 天開(kāi)始抗病品種的增加率均高于感病品種，由高到低依次為QK2502（HR）、QG70（R）、LQ66（MR）、QG50（S）、B02（HS）；SOD 活性增加率表現(xiàn)出先升高（1、3 d）后降低（5 d）再升高（7 d）的趨勢(shì)，QG50（S）表現(xiàn)出先升高（1 d）后降低（3、5、7 d）的趨勢(shì)。接種初期，抗病性與SOD 活性變化率之間沒(méi)有表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性，但隨著時(shí)間推移，抗病品種的SOD 活性增加率普遍高于感病品種，與其他學(xué)者的研究相吻合。葉片POD 活性、SOD 活性增加可能是植株為了抵抗黑腐病菌侵害產(chǎn)生的保護(hù)性反應(yīng)，從而增加植株對(duì)黑腐病菌的抵抗能力，抗病品種的抵抗力較感病品種強(qiáng)，體現(xiàn)在POD 活性、SOD 活性增加率上則為抗病品種高于感病品種。PAL 活性表現(xiàn)為抗病品種普遍高于感病品種，與其他學(xué)者研究一致。接種后第1 天，無(wú)論是抗病還是感病品種，PAL活性增加率均達(dá)到峰值，之后開(kāi)始下降，PAL 活性增加率與抗病性呈明顯正相關(guān)，但3、5、7 d 的QG50、B02 以及7 d 的LQ66 葉片PAL 活性低于對(duì)照，這可能是由于植株自身的防御系統(tǒng)被病原菌破壞所導(dǎo)致。

綜上，接種黑腐病菌后導(dǎo)致甘藍(lán)幼苗根系生長(zhǎng)緩慢，根長(zhǎng)和根系鮮重增加較慢，均低于未接種植株，且抗病品種受病原菌侵染的影響小于感病品種；根系活力相反，病原菌侵染會(huì)使根系活力提高，且抗病品種根系活力增加率高于感病品種。接種黑腐病菌后，植株的防御機(jī)制啟動(dòng)，POD 活性、SOD活性和PAL 活性升高，且抗病品種酶活性增加率普遍高于感病品種。因此，根長(zhǎng)、根系鮮重、根系活力、葉片POD 活性、葉片SOD 活性、葉片PAL 活性可以作為甘藍(lán)抗黑腐病種質(zhì)資源鑒定的輔助指標(biāo)。