C株豬瘟病毒NS3蛋白抗原表位分析及分段表達活性檢測

丁國偉,李甜甜,徐 萍,魏榮榮,李 琛,王設市,潘 晨,范 娟

(揚州市揚州優邦生物藥品有限公司,江蘇揚州 225008)

豬瘟是一種由豬瘟病毒感染引起的傳染病,給全球范圍內的養豬行業造成了嚴重的經濟損失[1]。豬瘟病毒主要編碼12種蛋白,其中病毒增殖所必需的非結構蛋白之一就是NS3蛋白[2-3],且該蛋白高度保守。機體感染豬瘟病毒后可檢測到NS3抗體[4]。豬瘟病毒感染豬后引起發熱,體溫升高,出血壞死等典型癥狀[5],具有非常高的發病率,混合感染引起的死亡率也很高。屬于1類傳染病,目前尚缺乏很好的治療方法,一旦發病立即采取撲殺措施,是養豬業所面臨的難題[6]。

NS3蛋白是由NS2-3蛋白進一步加工而成,其編碼基因長達2 049 bp,具有多種酶活性,該蛋白功能比較多[7]。并且NS3的生物學特征和基因序列在不同毒株之間沒有顯著差異。大量研究證明,該蛋白免疫活性高,可以刺激機體使機體產生高水平的針對該蛋白的特異性抗體。由于NS3所誘導產生的抗體的保護性未得到驗證,因此,雖然不適合用于制備疫苗,但是可以通過檢測NS3的抗體來對豬瘟進行診斷。因此,在CSFV的檢測與診斷方面,研制抗NS3蛋白的診斷試劑盒將受到關注。筆者使用原核表達系統pET-28a對NS3的基因片段進行了分割連接,然后進行表達和純化,獲得具有免疫活性的截短蛋白,為今后豬瘟病毒的鑒別診斷等提供材料。

1 材料與方法

1.1 菌株及載體該研究使用的經典豬瘟毒株為經典C株,表達載體為pET-28a,表達菌株為BL21(DE3),均為實驗室保存。

1.2 主要試劑分子生物學試劑主要有:2×TaqMaster Mix、DEPC(焦碳酸乙二酯)、T4連接酶、Trizol LS resgent(Invitrogen)、EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix、HindIII、BamHI、SalI和DNA Marker、Agarose Gel DNA Extraction Kit、PCR clean up kit、IPTG、RNaseA和X-gal等。

1.3 方法

1.3.1病毒cDNA的獲得。通過Trizol方法提取豬瘟病毒RNA,并根據北京全式金生物技術的逆轉錄試劑盒的說明對RNA進行逆轉錄,并在-20 ℃下保存備用。

1.3.2NS3全基因測序分析。參考GenBank中比對CSFV的NS3全基因序列,設計1對引物NS3-F、NS3 -R;將cDNA送至生物技術公司進行測序。然后用DNAStar軟件中的Protean分析NS3蛋白的二級結構、親水性、表面可及性、可塑性和抗原表位進行分析[8]。

1.3.3引物設計與合成及目的基因的獲得。在分析CSFV C株的NS3基因及蛋白序列后,截獲第1段,即a段第1～212位氨基酸、b段第189～389位氨基酸以及c段第390～591位氨基酸;并設計相應引物NS3a-F/R、NS3b-F/R和NS3c-F/R,在起始端加上BamH I酶切位點,在終止端加上Sal I酶切位點,送至生物公司進行合成,引物使用濃度為20 μmol/L,于-20 ℃凍存備用,上述引物可以分別擴增出a、b、c 3段基因片段,a段位于1～212位氨基酸,b段位于189～389位氨基酸,c段位于390～591位氨基酸,大小分別為645、609和615 bp(圖1)。a、b、c 3段基因引物設計為NS3a-F:CGCGGATCCATGGGCAGGGGGCCCGCTGTTTG;NS3a-R:ACGCGTCGACTTACTTCACCATCTCCGTCAAGTCCGTG;NS3b-F:CGCGGATCCATGGGCAAACCAACCAAGCTCATG;NS3b-R:ACGC-GTCGACTTAGGCAATGTCCAAGTAATCTGAACCTAAG;NS3c-F:CGCGGATCCATGGGCGGACTGAAGATACCAGTAG;NS3c-R:ACGCGTCGACTTACATTATATTTTTTACTGCTACCGGCAAC。

圖1 NS3氨基酸分析與截取Fig.1 NS3 amino acid analysis and interception

1.3.4DNA片段的純化回收及連接轉化。 將目的條帶切膠后進行回收純化,純化后測定濃度并建立20 μL的雙酶切體系,將目的基因與pET-28a用BamH I和Sal I分別于37 ℃酶切2～3 h;限制酶消化后,按照Axygen試劑盒的說明書純化;然后建立20 μL連接體系進行4 ℃過夜連接;將連接產物轉化到受體菌中,并且靜置培養后,挑取陽性菌落培養并用于PCR鑒定。

1.4 重組質粒的PCR鑒定和測序用小提質粒試劑盒提取pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b與pET-28a-NS3c重組質粒。通過PCR鑒定上述重組質粒,并通過測序進一步驗證。

1.5 重組蛋白的表達及純化

1.5.1蛋白的誘導表達。將鑒定及測序正確的重組質粒pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b與pET-28a-NS3c轉化至表達菌株,用終濃度為1.0 mmol/L IPTG,37 ℃ 220 r/min搖床誘導表達4 h,同時,設置空載體對照組。通過離心收集細胞,重懸,并通過超聲波裂解儀裂解5 min,并離心5 min取上清液,用于蛋白質電泳分析。

1.5.2NS3b目的蛋白的大量表達及純化。將10 mL母液加入800 mL 抗Kana LB液體培養基中誘導表達5 h或過夜表達,離心收集菌體,對表達的重組蛋白CSFV-His-NS3b參照HisTrap HP組氨酸標記親和層析柱說明書進行Ni柱純化,具體方法如下:①用Ni柱上樣緩沖液將菌體洗2次,100 mL 重懸,超聲波裂解儀裂解10 min,懸液變得清透,蛋白可溶,離心并收集上清液;②用0.45 μm濾器將上述收集的上清進行過濾除雜;③用超純水清洗Ni柱后,用Ni柱上樣緩沖液平衡Ni柱;④上樣,并收集樣品備用;⑤上樣完成后用Ni柱上樣平衡緩沖液進行平衡,而后用含10 mmol/L咪唑除雜液進行除雜,每步留樣備用;⑥最后用洗脫液洗脫Ni柱結合的蛋白,收集保存樣品;⑦洗脫后用Ni柱上樣緩沖液平衡Ni柱,之后以0.01 mol/L NaOH洗柱,再以 20%乙醇過柱,4 ℃保存。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒及ELISA 2種方法,測得蛋白濃度約為5 mg/mL。

1.6 免疫原的分析鑒定

1.6.1SDS-PAGE分析鑒定。SDS-PAGE電泳前蛋白預處理:取40 μL純化后的CSFV-His-NS3重組蛋白加入10 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液,混勻,金屬浴95 ℃ 7 min,冰浴5 min,12 000 r/min離心5 min,4 ℃保存備用。

SDS-PAGE電泳:將2玻璃板固定于加樣器上;按照試劑盒A盒配制12%分離膠5 mL;20 min后棄去超純水并用濾紙吸凈;再按照B盒說明書配制5%濃縮膠2 mL;將濃縮膠加入玻璃板中,迅速準確插入梳子,固化30 min;然后拔出梳子,每孔加入10 μL樣品。在開始時以240 V電壓跑膠30 min,直到溴酚藍距下緣0.5 cm時停止電泳。膠塊切2塊,一塊用于Western-blot鑒定,另一塊用考馬斯亮藍進行染色,水平搖床染色30 min,而后脫色搖床脫色觀察并拍照。

1.6.2Western-blot分析鑒定。SDS-PAGE電泳后的凝膠用去離子水沖洗1次,切割硝酸纖維素膜和濾紙,其大小與膠塊相同,浸入轉移緩沖液中5 min;轉印裝置安裝順序按黑色面板為負極,白色面板為正極放入,標記硝酸纖維素薄膜的正負極,玻璃棒除去各層之間的殘留氣泡,并在轉移裝置中以240 V轉移1.5 h。

轉移結束后,通過預染標準分子量標記觀察效果,洗滌后封閉2 h;一抗采用豬陽性血清,4 ℃過夜;二抗采用辣根過氧化物酶(HRP)標記的小鼠抗豬IgG(1∶2 000稀釋),37 ℃搖床100 r/min,2 h;最后以新鮮的TMB著色溶液,在避光的環境下進行顯色。

2 結果與分析

2.1 NS3基因測序通過測序測得NS3基因為2 046 bp大小,與理論大小一致。

2.2 NS3蛋白分析結果

2.2.1NS3二級結構。

2.2.1.1NS3全蛋白α螺旋結構。NS3全蛋白1～682的α螺旋結構在3～25、45～49、96～102、122～125、130～137、205～215、240～249、256～268、276～292、306～347、365～403、469～480、489～496、498～503、530～536、559～595、632～642、647～659和671～682位氨基酸殘基,共285個氨基酸,共占整個序列42%。其中,a段1～212位氨基酸,α螺旋結構在5～29、47～51、98～104、132～139、154～164和207～215,共65個氨基酸,共占30%;b段189～389位氨基酸,α螺旋結構在19～29、54～63、70～82、90～106、120～161和179～204,共119個氨基酸,共占58%;c段390～591位氨基酸,α螺旋結構在7～16、2～34、82～93、102～109、111～116、143～149和172～205,共92個氨基酸,共占44%。

2.2.1.2NS3全蛋白β折疊結構。NS3全蛋白的β折疊結構在37～44、58～61、65～73、77～91、114～121、124～126、142～147、176～184、193～202、210～217、222～229、250～256、262～269、292～296、301～305、346～352、356～362、402～407、437～444、446～455、456～468、484～489、493～499、508～513、536～553、609～617、669～673和678～682位氨基酸殘基,共218個氨基酸,占該段氨基酸序列32.0%。a段β折疊結構在39～46、60～63、67～75、79～93、116～123、126～128、144～149、178～186和195～204,共72個氨基酸,占該段序列34%;b段β折疊結構在6～16、24～31、36～43、64～70、76～83、106～110、115～119、160～166和170～176,共66個氨基酸,共占32.4%;c段β折疊結構在15～20、50～57、59～68、69～81、97～102、106～112、121～126和149～166,共74個氨基酸,占該段氨基酸序列36.1%。

2.2.1.3NS3全蛋白β轉角結構。NS3全蛋白β轉角結構共224個氨基酸,分布較均勻緊湊,共占整個氨基酸序列32.8%。a段β轉角結構,共92個氨基酸,占該段序列42.8%;b段β轉角結構共48個氨基酸,占該段序列32.4%;c段β轉角結構共72個氨基酸,占該段序列35.1%。

2.2.1.4NS3全蛋白無規則卷曲結構。NS3全蛋白無規則卷曲在30～31、34～36、53～55、94～97、128～129、150～151、172～173、203～204、218～220、229～232、271～173、305～306、353～354、362～366、434～435、595～597、618～621、663～666和668～670,共55個氨基酸,共占整個氨基酸序列8.1%。a段20位氨基酸,占該段序列9.3%;b段22位氨基酸,占該段序列10.8%;c段5位氨基酸,占該段序列2.4%。

2.2.2NS3蛋白親水性。NS3全蛋白親水性結構在501～506、512～521、527～570、605～609、624～629和649～652位氨基酸殘基,共34個氨基酸,共占整個序列5%。a段親水結構共116個氨基酸,占該段序列54.5%;b段親水結構共103個氨基酸,占該段序列51%;c段親水結構共104個氨基酸,占該段序列51.3%。

2.2.3NS3蛋白表面可及性。NS3全蛋白表面可及性結構在9～15、32～38、92～100、183、191、233～237、266、272、305～308、361～366、396～399、415～436、501～507、512～521、527～530、605～609、624～629和649～652位氨基酸殘基,共102個氨基酸,共占整個序列15%。a段表面可及性在11～16、35～39、94～102和185～193,共29個氨基酸,占該段氨基酸序列13.5%;b段表面可及性在2～6、47～51、59～63、80～86、119～122和176～181,共32個氨基酸,占該段氨基酸序列15.7%;c段表面可及性在44～49、114～120、125～135、140～143和166～177,共33個氨基酸,占該段氨基酸序列16.1%。

2.2.4NS3蛋白可塑性。NS3全蛋白可塑性區域在8～17、31～38、43～55、62～67、75～76、82～86、91～102、104～113、126～131、137～142、148～152、158～164、171～176、179～193、196～208、212～223、229～240、244～249、269～273、282～289、305～308、328～331、353～377、376～385、396～400、407～409、417～427、431～437、442～446、456～463、469～477、481～483、490～492、499～528、542～552、562～564、581～582、596～600、607～610、616～628、635～644、649～653和664～678位氨基酸殘基,共352個氨基酸,共占整個序列52%。其中,a段125個氨基酸,占該段序列58.1%,b段91個氨基酸,占該段序列44.6%;c段150個氨基酸,占該段序列73.1%。

2.2.5NS3蛋白B細胞抗原表位。`NS3全蛋白B細胞抗原表位在393～401、407～412、414～427、431～439、454～459、470～484、490～495、500～530、537～547、549～558、560～566、581～585、594～600、605～608、616～631、636～643、649～655和660～679位氨基酸殘基,共191個氨基酸,共占整個氨基酸序列28%,其中,a段153個氨基酸,占該段序列71.2%,b段125個氨基酸,占該段序列61.3%,c段134個氨基酸,占該段序列65.4%。

2.2.6NS3蛋白T細胞抗原表位。NS3全蛋白T細胞抗原表位在2～12、13～14、16～20、21～25、27～32、34～56、81～94、99～106、110～113、137～142、158～164、174～185、192～224、234～251、252～271、305～315、332～351、390～397、412～425、434～444、463～487、488～508、513～515、533～557、580～589、602～606、610～617、634～643和664～666位氨基酸殘基,共343個氨基酸,共占整個序列的51%。其中,a段105個氨基酸,占該段48.8%;b段92個氨基酸,占該段45.0%;c段115個氨基酸,占該段56.0%(圖2～5)。

圖2 NS3蛋白二級結構和抗原表位預測Fig.2 Prediction of protein secondary structure and epitope of NS3 protein

圖3 NS3蛋白a段二級結構和抗原表位預測Fig.3 Prediction of the protein secondary structure and epitope of NS3 protein segment a

圖4 NS3蛋白b段二級結構和抗原表位預測Fig.4 Prediction of the protein secondary structure and epitope of NS3 protein segment b

圖5 NS3蛋白c段二級結構和抗原表位預測Fig.5 Prediction of the protein secondary structure and epitope of NS3 protein segment c

2.3 NS3a、NS3b和NS3c基因的擴增將NS3a、NS3b和NS3c基因PCR擴增,分別得到645、609與615 bp的條帶(圖6),與理論大小一致。

注:M.DL 5 000 DNA ladder marker;1.PCR擴增 NS3a基因;2.PCR擴增 NS3b基因;3.PCR擴增 NS3c基因。Note:M.DL 5 000 DNA ladder marker;1. PCR amplification of NS3a gene;2. PCR amplification of NS3b gene;3. PCR amplification of NS3c gene.圖6 NS3基因的PCR擴增結果Fig.6 PCR amplification results of NS3 gene

2.4 重組質粒pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b與pET-28a-NS3c PCR鑒定pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b與pET-28a-NS3c重組質粒用通用引物T7-P/T進行PCR鑒定,結果與理論大小一致(圖7),且測序結果正確。

注:M.DL 5 000 DNA ladder marker;1.pET-28a-NS3a質粒;2.pET-28a-NS3b質粒;3.pET-28a-NS3c質粒;4.pET-28a空載體。Note:M. DL 5 000 DNA ladder marker; 1. PET-28a-NS3a plasmid;2.pET-28a-NS3b plasmid;3.pET-28a-NS3c plasmid;4. pET-28a empty carrier.圖7 重組質粒pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b與pET-28a-NS3c基因的PCR鑒定結果Fig.7 PCR identification results of recombinant plasmids pET-28a-NS3a, pET-28a-NS3b, and pET-28a-NS3c genes

2.5 NS3a、NS3b和NS3c蛋白表達結果將含pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b與pET-28a-NS3c重組質粒的BL21重組表達菌株進行誘導表達,表達產物經煮沸變性離心后SDS-PAGE分析,其中,a段表達量很低且不可溶,b段在27 kD處出現明顯的目的條帶,c段未出現表達條帶。a段、b段與預期大小符合,同時設置pET-28a空載體組為對照(圖8)。

注:M.蛋白預染 marker;1.pET-28a空載體;2.pET-28a-NS3a質粒;3.pET-28a-NS3b質粒;4.pET-28a-NS3c質粒;紅框為目的條帶。Note:M.Protein pre staining marker;1. PET-28a empty carrier;2. PET-28a-NS3a plasmid;3. PET-28a-NS3b plasmid;4. PET-28a-NS3c plasmid;The red box refers to the destination strip.圖8 NS3a、NS3b、NS3c蛋白表達Fig.8 Protein expression of NS3a、NS3b、NS3c

2.6 重組蛋白CSFV-His-NS3b的純化與活性驗證純化與活性驗證結果見圖9。

注:M.蛋白預染 marker;1. pET-28a空載體對照;2. CSFV-His-NS3b重組蛋白;紅框為目的條帶。Note:M. Protein pre staining marker;1. PET-28a empty carrier control;2. CSFV His NS3b recombinant protein;the red box refers to the destination strip.圖9 純化CSFV-His-NS3b重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.9 SDS-PAGE analysis of purified CSFV-His NS3b recombinant protein

2.7 重組蛋白ELISA濃度測定通過EDXX ELISA試劑盒定量檢測CSFV-His-NS3b重組蛋白,測定蛋白濃度約5 mg/mL,SDS-PAGE分析結果見圖10。

注:M.蛋白預染 marker;1.pET-28a空載體對照;2.CSFV-His-NS3b重組蛋白;紅框為目的條帶。Note:M. Protein pre-staining marker;1.pET-28a empty carrier control;2. CSFV-His-NS3b recombinant protein;the red box refers to the destination strip.圖10 純化CSFV-His-NS3b重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.10 SDS-PAGE analysis of purified CSFV-His-NS3b recombinant protein

3 討論與分析

近年來,豬瘟病毒已經對全球養豬業造成了重大危害,并且該病毒可與其他病原包括PCV2、PRRSV等發生混合感染[9],使病情加重,因此,及時有效地診斷可以有效避免繼發感染帶來的經濟損失,而豬瘟的診斷也一直被作為重點研究對象[10]。NS3蛋白在機體內能誘導NS3特異性抗體產生,且NS3抗體能夠用于區分自然感染和疫苗毒,因此,NS3蛋白在豬瘟的鑒別診斷中具有重要作用。

NS3蛋白全基因比較長,而小分子的蛋白更容易表達,因此,筆者對NS3蛋白的親水性、抗原表位等功能活性區域進行了分析。二級結構中的α螺旋主要位于205～423位氨基酸,說明該段的穩定性比較好;β折疊在37～540位氨基酸均勻分布;β轉角在32～175分布比較緊湊,在270～673較分散;無規則卷曲主要分布在30～436,由于無規則卷曲β轉角在蛋白中的位置,使其成為原表位的可能性較大;親水性分析顯示分布較均勻,沒有明顯波動;B細胞表位分析分布于1～277位和415～682位氨基酸,T細胞表位分析主要位于173～560位氨基酸。選取了a、b、c 3段預測序列進行分段表達。分割后的結構域和抗原表位百分比相比全長有所增加,3段的抗原表位分布相差不大,均可選為候選抗原蛋白,但是預測結果僅可作為參考,最終確定需要進一步進行實際表達來驗證。

原核表達這一技術已經非常成熟也易于純化,筆者選擇使用pET-28a原核表達系統進行表達。其中只有b段區域能夠表達,a段、c段沒有檢測到表達,且b段可大量表達且可溶性較好,表達條件不苛刻,無需摸索,且無需復可以直接進行Ni柱純化。純化后的蛋白經SDS-PAGE電泳顯示條帶單一無雜帶,可見所獲得的蛋白純度非常高。用抗豬CSFV陽性血清進行Western-blot試驗,結果出現單一的特異性條帶,大小符合實際大小,用BCA蛋白檢測試劑盒以及ELISA方法均測得蛋白濃度可達5 mg/mL,說明該重組蛋白不僅表達量高,其特異性和免疫活性也非常高。

綜上所述,b段相較于a、c段能夠很好地表達,推測可能與其穩定性有關,因為α螺旋集中分布在205～423位氨基酸,并且α螺旋對蛋白的穩定性具有重要作用[11]。該研究進行的蛋白結構分析及所構建的蛋白表對進一步研究豬瘟病毒的致病機理、診斷試劑盒和疫苗的研究與開發等具有重要意義。