超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定護(hù)肝片（膠囊）中柴胡皂苷K 含量*

錢 鑫，黃婉鋒，潘志文

（廣東省佛山市食品藥品檢驗檢測中心，廣東 佛山 528051）

護(hù)肝片（膠囊）由柴胡、茵陳、板藍(lán)根、五味子、豬膽粉和綠豆組方，有疏肝理氣、健脾消食功效，且具有降低轉(zhuǎn)氨酶的作用，臨床用于治療慢性肝炎及早期肝硬化。方中柴胡為君藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］，是傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifoliumWilld.的干燥根［2］293（按性狀不同，分別稱“北柴胡”和“南柴胡”），市場上柴胡種類繁雜，存在用藥混亂、基源不清、非藥用部位混用等問題［3-8］。窄竹葉柴胡是柴胡的主要偽品，存在嚴(yán)重的造假風(fēng)險［9-13］；竹葉柴胡、錐葉柴胡的混用也會威脅制劑的安全生產(chǎn)。護(hù)肝片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)有3 個［2］1031，［14-15］，護(hù)肝膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)有1個［2］1032，但上述標(biāo)準(zhǔn)均未對窄竹葉柴胡進(jìn)行有效的風(fēng)險控制。本課題組前期對窄竹葉柴胡的特征性成分進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷K 含量極高，約為其他品種柴胡的40 倍［11］。為此，本研究中建立了測定護(hù)肝片（膠囊）中柴胡皂苷K 含量的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法，以為該制劑的質(zhì)量評價提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Xevo - TQ 型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Waters公司，配有自動進(jìn)樣器、電噴霧接口、Empower 色譜工作站）；AB265 - S 型電子天平、XPR10 型超微量天平，均購自瑞士Mettler Toledo 公司）；S180/ H 型超聲波清洗器（德國Elma 公司）；MS2 型迷你渦旋振蕩器（德國IKA 公司）。

1.2 試藥

護(hù)肝片（A 廠20 批，B 廠6 批，C 廠5 批，I 廠4 批，D 廠3批，E 廠、F 廠各2批，G 廠、H 廠、J廠各1批）；護(hù)肝膠囊（K 廠、L 廠各1 批）；柴胡皂苷K 對照品（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號為7285，含量98.0%）；甲醇、乙腈均為色譜純，甲酸為優(yōu)級純，水為超純水。北柴胡（中國食品藥品檢定研究院/ 廣東省藥材公司中藥飲片廠/國藥集團(tuán)馮了性<佛山>藥材飲片有限公司，批號分別為120992 - 201509，B5769112，20210108）；窄竹葉柴胡（亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司/ 梅州市上善若水中藥材有限公司/ 廣東省廣州市清平藥材市場，批號分別為20201020，20201020，20201104）；竹葉柴胡（四川尋百草藥業(yè)有限公司/ 中國食品藥品檢定研究院，批號分別為2020529，121343-201903）；錐葉柴胡（廣東省廣州市清平藥材市場，批號為2020522）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH-C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～1 min 時10%A，1～19 min 時10%A →60%A，19～20 min 時60%A →90%A，20～22 min 時90%A，22～22.1 min 時90%A →10%A，22.1～24 min 時10%A）；流速：0.30 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：1μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，負(fù)離子檢測，多反應(yīng)監(jiān)測模式；離子源溫度：150 ℃；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；脫溶劑溫度：500 ℃；錐孔氣流量（氮氣）：50 L/h；碰撞氣流速（氬氣）：0.15 L/h；氮氣流量：800 L/h。質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜檢測參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry detection parameters

2.2 溶液制備

取柴胡皂苷K對照品5.120 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得對照品溶液。分別精密量取0.10，0.25，0.50，1.25，2.50 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.200 7，0.501 8，1.003 5，2.508 8，5.017 6 μg/ mL 的系列對照品溶液。取裝量差異項樣品粉末（內(nèi)容物）1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率350 W、頻率37 kHz，下同）處理30 min，取出，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。分別取北柴胡、窄竹葉柴胡、竹葉柴胡、錐葉柴胡適量，按護(hù)肝片處方和制法制備護(hù)肝片標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品、窄竹葉柴胡樣品、竹葉柴胡樣品、錐葉柴胡樣品，作為對照藥材溶液。按護(hù)肝片處方及工藝制備缺北柴胡的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：分別精密吸取2.2 項下對照溶液、供試品溶液各適量，按2.1項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄總離子流圖（TIC）、子離子質(zhì)譜圖。詳見圖1、圖2。

圖1 總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms

圖2 子離子質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrogram of daughter ions

專屬性試驗：取2.2項下對照藥材溶液與陰性對照品溶液，按2.1 項下試驗條件進(jìn)樣測定，采用外標(biāo)法計算柴胡皂苷K 的含量。結(jié)果上述樣品中，柴胡皂苷K 含量分別為0.611 3，39.594 8，0.954 7，1.127 6，0μg/g，窄竹葉柴胡樣品中柴胡皂苷K 的含量約為護(hù)肝片標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品中的65倍，且陰性對照無干擾。

線性關(guān)系考察：取2.2 項下系列對照品溶液適量，按2.1 項下試驗條件進(jìn)樣測定。以待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 1 029.5X- 1.135 4（r= 0.999 9，n= 5）。結(jié)果表明，柴胡皂苷K 質(zhì)量濃度在0.200 7～5.017 6μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限考察：取2.2 項下對照品溶液適量，逐級稀釋，按2.1項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以信噪比分別為3∶1 和10∶1 時的待測成分質(zhì)量濃度記為檢測限和定量限。結(jié)果檢測限為0.05 mg/kg，定量限為0.20 mg/kg。

精密度試驗：取同一批（批號為200503）樣品適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下試驗條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果柴胡皂苷K 峰面積的RSD為1.91%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品（批號為200503）溶液適量，分別于室溫放置0，2，4，8，12，24，48 h 時按2.1 項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果柴胡皂苷K 峰面積的RSD為2.27%（n= 7），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為200503）樣品適量，平行6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果柴胡皂苷K 的平均含量為0.488 9μg/mL，RSD為1.26%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取同一批（批號為200503）樣品適量，平行9份，精密稱定，分別加入質(zhì)量濃度為100μg/mL的對照品溶液0.04，0.20，0.80 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0212 藥材和飲片檢定通則［16］規(guī)定，雜質(zhì)通常不得超過3%。由于柴胡藥材基源復(fù)雜，故將限度放寬為10%。以90%北柴胡中摻10%窄竹葉柴胡擬訂柴胡皂苷K 的含量限度為4.5μg/g。取各批樣品適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件進(jìn)樣測定，采用外標(biāo)法計算柴胡皂苷K 的含量（見表3，其中K 廠、L 廠產(chǎn)品為膠囊劑，其余廠產(chǎn)品均為片劑）。結(jié)果顯示，8 個生產(chǎn)廠家（A，B，D，E，G，H，J，K）的28批樣品含量在擬合限度范圍內(nèi)。

表3 護(hù)肝片（膠囊）中柴胡皂苷K含量測定結(jié)果（μg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of nepasaikosaponin K in Hugan Tablets and Hugan Capsules（μg/g，n=3）

3 討論

預(yù)試驗中樣品提取方法考察了提取溶劑（甲醇、乙腈、50%甲醇溶液），提取方式（超聲處理、加熱回流）及提取時間（10，30，60 min）對柴胡皂苷K 提取效果的影響。結(jié)果柴胡皂苷K在不同組合中提取效率有差異，綜合提取效率和溶劑效應(yīng)，選擇甲醇提取，超聲處理30 min。

色譜條件，流動相考察了甲醇- 水，甲醇- 0.1 %甲酸水溶液，乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸水溶液，結(jié)果以乙腈-水流動相測得峰形對稱，出峰時間穩(wěn)定，分離度最佳；色譜柱考察了AgilentSB-C18柱（100mm×2.1mm，1.8 μm），Waters Acquity UPLC BEH - C18柱（50 mm ×2.1 mm，1.7μm），Waters X Bridge C18柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）的分離度和重復(fù)性，結(jié)果前兩者均符合要求，故色譜柱內(nèi)徑選擇1.7μm或1.8μm。

綜上所述，本研究中建立的方法操作簡便，靈敏度高，結(jié)果真實可靠，可為監(jiān)測護(hù)肝片（膠囊）中的非法添加成分提供參考。但本研究尚存在不足，如未充分考察北柴胡、窄竹葉柴胡及竹葉柴胡在不同產(chǎn)地、不同采收期和不同炮制品間的含量差異［17-19］；同時未分離檢測柴胡中柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、柴胡皂苷E 等代表性成分［20-21］。后續(xù)可進(jìn)一步增加藥材品種，優(yōu)化供試品制備及分析條件。