一測多評法同時測定結石通片中7 種成分含量

聶 溶，蔡林雪，孟倩穎

（中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院，福建 福州 350000）

結石通片由廣金錢草、石韋、玉米須、車前草、茯苓、雞骨草、白茅根、海金沙草8 味藥材組方，具有清熱利濕、通淋排石、鎮痛止血功效，臨床用于治療泌尿系統感染、尿路結石、血尿、腎炎水腫等病癥［1］。其現行質量標準中僅有廣金錢草的薄層色譜鑒別項及片劑通則檢查項，且文獻報道僅對有效成分綠原酸進行了定量控制［2］，難以全面評價該制劑的質量。一測多評（QAMS）法能通過建立相對易得且穩定成分與其他組分之間的相對較正因子（RCF），同步實現多指標含量測定［3-4］。2020 年版《中國藥典（一部）》收錄了咳特靈膠囊、銀杏葉滴丸等中成藥含量測定的QAMS 法［5］，亦有研究采用QAMS 法評價中藥制劑質量［6-8］。本研究中采用QAMS 法同時測定結石通片中7 種成分的含量，以期為提升該制劑的質量提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司，配有2689 型VWD 紫外檢測器）；XP505 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01mg）；KQ -500DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

結石通片（陜西康惠制藥股份有限公司，批號分別為20211019，20211126，20211222，220314，220507，220620）；夏佛塔苷對照品（批號為111912-202204，含量94.9%），綠原酸對照品（批號為110753-202119，含量96.3%），芒果苷對照品（批號為111528-202210，含量96.6%），大車前苷對照品（批號為11557 - 202003，含量98.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；異夏佛塔苷對照品（批號為TT20022384，含量92.8%），異牡荊苷對照品（批號為TT2108367，含量97.6%），茯苓酸對照品（批號為TT2205121，含量99.1%），均購自上海同田生物技術有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters SunFire C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）- 0.15%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min 時12%A →26%A，20～30 min 時26%A →35%A，30～38 min 時35%A，38～44 min 時35%A →40%A，44～55 min 時40%A →85%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：330 nm（0～44 min時，夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊苷、綠原酸、芒果苷、大車前苷），210 nm（44～55 min時，茯苓酸）；柱溫：35 ℃；進樣量：10μL［9-11］。

2.2 溶液制備

取各對照品適量，精密稱定，加甲醇，制成夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊苷、綠原酸、芒果苷、大車前苷、茯苓酸質量濃度分別為0.386 1，0.131 4，0.292 4，0.512 8，0.403 7，0.228 5，0.230 9 mg/mL 的混合對照品貯備液；精密量取樣品2 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，即得混合對照品溶液，室溫避光貯藏。取樣品10片，除去包衣，研勻，取1.0 g，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，加75%甲醇85 mL，超聲（功率450 W、頻率40 kHz，下同）處理45 min，放冷，加75%甲醇定容，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液，室溫避光貯藏。按結石通片處方及工藝，分別制備缺廣金錢草、石韋、玉米須、車前草、茯苓的單一陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備各陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性及專屬性試驗：取2.2 項下3 種溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（見圖1）。結果理論板數按各成分色譜峰計均大于3 500，分離度均大于1.5；陰性對照均無干擾，表明專屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密量取2.2項下混合對照品貯備液0.2，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別加甲醇制成系列混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 方法學考察結果Tab.1 Results of methodological investigation

檢測限與定量限考察：取2.2 項下對照品溶液適量，用甲醇逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比（S/N）約為3∶1、10∶1時待測成分的質量濃度為檢測限和定量限。結果見表1。

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。取同一批供試品溶液（批號為220314）適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，連續3 d，每日進樣3 次。結果的RSD均小于2.0%（n=6），詳見表1，表明儀器日內精密度良好，方法日間精密度良好。

穩定性試驗；取同一批（批號為220314）供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，4，8，15，20，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD均小于2.0%（n=6），詳見表1。表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗；取同一批（批號為220314）樣品適量，按2.2項下方法平行制備供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果的RSD均小于2.0%（n=6），詳見表1。表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為220314）0.5 g，平行6 份，精密稱定，置棕色容量瓶中，加入混合對照品溶液適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

2.4 RCF 測定

取線性關系考察項下系列混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖及峰面積。以綠原酸為內參物，按公式RCFk/s=（Ck×As）/（Cs×Ak）計算（其中，C 為質量濃度，A 為峰面積，k 指其他6 種待測成分之一，s指內參物）。結果見表2。

表2 6種成分的相對校正因子（n=6）Tab.2 RCFs of six components（n=6）

2.5 RCF 耐用性考察

色譜儀和色譜柱：取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件，采用2 種高效液相色譜儀（Waters e2695型和Agilent 1260型）和3種色譜柱（Thermo Scientific Acclaim 160 C18柱、Waters SunFire C18柱及Agilent ZORBAX SB C18柱，規格均為250 mm×4.6 mm，5μm）分別進樣測定，記錄峰面積，并計算RCF。結果夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊苷、芒果苷、大車前苷和茯苓酸的平均RCF 分別為1.333，1.673，1.948，1.953，1.257，1.350，RSD分別為1.74%，1.07%，1.16%，1.05%，1.36%，1.58%。表明色譜儀、色譜柱發生一定變化時本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。

柱溫：取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件，采用不同柱溫（25，30，35 ℃）進樣測定，記錄峰面積并計算RCF。結果夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊苷、芒果苷、大車前苷和茯苓酸的平均RCF 分別為1.325，1.667，1.964，1.938，1.253，1.341，RSD分別為1.14%，0.94%，1.12%，0.88%，1.54%，1.09%（n= 3），表明柱溫發生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。

2.6 QAMS 法與外標（ESM）法測定結果比較

取6 批樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，平行3 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊苷、綠原酸、芒果苷、大車前苷、茯苓酸的峰面積，分別采用ESM 法和QAMS 法計算各成分含量，組間比較行t檢驗。結果表明，2 種測定方法的結果無顯著差異（P>0.05）。詳見表3。

表3 樣品中7種成分一測多評法和外標法含量測定結果比較（mg/g，n=3）Tab.3 Comparison of content determination of seven components in samples by QAMS and ESM（mg/g，n=3）

3 討論

結石通片中廣金錢草清熱利尿、通淋利濕，為君藥；石韋利尿通淋、涼血止血，車前草清熱利尿、通淋止痛，茯苓淡滲利濕、通利膀胱，共為臣藥；玉米須利尿通淋，為佐藥；雞骨草、白茅根、海金沙草清熱利尿解毒，共為使藥。研究表明，廣金錢草中藥效成分主要為夏佛塔苷、異夏佛塔苷黃酮類化合物和綠原酸酚酸類化合物［12］；石韋中芒果苷屬雙苯吡酮類化合物，具有利尿護腎、抗炎等作用［13］；車前草中大車前苷屬苯乙醇苷類化合物［14-15］，具有抗氧化、抗菌、免疫調節等藥理作用，是2020 年版《中國藥典（一部）》中評價車前草質量的代表性成分；茯苓主要藥效成分為三萜類和多糖類，三萜類中茯苓酸含量較高，具有利尿、促進神經伸展等作用［16］；玉米須中主要藥效成分為黃酮類成分異牡荊苷［17］。因所需對照品品種多、價格昂貴，且不易獲得，在日常檢驗中較難同時測定7種成分含量，故采用QAMS 法，以綠原酸為內參物，測定其余6 種成分的RCF，并計算含量，從而實現結石通片的多指標質量評價。

QAMS法和ESM法的測定結果差異不明顯，提示本研究中所建立的方法結果準確，可用于結石通片的多種有效成分的含量測定。但目標成分含量存在一定的批間差異，如芒果苷含量為0.611～0.700 mg/ g，異夏佛塔苷含量為0.200～0.257 mg/g，可能與制劑的原藥材產地、采收、加工等有關，故建立多指標成分評價模式有助于確保結石通片質量的穩定。

綜上所述，本研究中建立了同時測定結石通片中7 種成分含量的QAMS 法，且操作簡便、結果準確，可用于結石通片多指標成分的質量控制，繼而為全面評價該制劑質量提供參考。