鹽酸氨基葡萄糖片中吡嗪類雜質含量測定及成因分析*

王瓊芬，倪東宇，張夢奇，李 彬，石 婧，徐 虹

（浙江省舟山市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江 舟山 316000）

氨基葡萄糖是從甲殼類動物的殼聚糖和甲殼素外骨骼中提取的氨基單糖，經鹽酸化和硫酸化后，變成穩定的可供口服的鹽酸鹽和硫酸鹽［1］。該糖是人體關節軟骨基質中合成蛋白聚糖所必需的物質，能有效促進人體黏多糖的合成，提高關節滑液的黏性，有助于軟骨細胞的修復［2-4］。由于氨基葡萄糖結構中含有氨基和羰基，導致在生產、儲存過程中很易發生由美拉德反應引起的非酶褐變，產生多種褐變產物，其中主要褐變產物為多羥基烷基吡嗪類化合物［5］。目前，該類化合物主要包括果糖嗪和脫氧果糖嗪，在歐洲藥典（EP）10.0 版氨基葡萄糖鹽酸鹽和硫酸復鹽原料藥有關物質檢查項下，果糖嗪和脫氧果糖嗪已作為非特定雜質進行控制［6］。國內原料藥尚未收載該檢查項［7］，少數企業制劑注冊標準（YBH03592014，YBH05342020）中已有收載。

目前，有關氨基葡萄糖原料和制劑有關物質測定方法及其生產工藝相關研究已有文獻報道［8-11］，但尚未見有關吡嗪類雜質形成影響因素及相關動力學分析的報道。前期研究中，項目組對多批次不同廠家鹽酸氨基葡萄糖原料和制劑中2 種吡嗪類雜質進行了含量測定，結果原料和膠囊中均未檢出，但片劑和顆粒中有不同程度檢出。由于片劑工藝較復雜，生產廠家相對較多，臨床使用更廣，不同廠家間采用的工藝特征和工藝參數不同，對該類雜質的形成影響較大［12］。本研究中以鹽酸氨基葡萄糖片為研究對象，采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中果糖嗪、脫氧果糖嗪含量，并通過考察不同溫度及相對濕度（RH）下2 種雜質的含量變化，探討制劑中該類雜質的形成影響因素和含量變化規律，旨在為制劑工藝參數優化和過程控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀，配DAD檢測器（美國Agilent公司）；XSE205DU型電子天平（精度為0.01 mg）、V30S型卡爾費休水分測定儀（瑞士Mettler Toledo 公司）；DHG-9071A 型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；KBF 240 型恒溫恒濕箱（德國Binder 公司）；KQ -250DV 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q型超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

果糖嗪對照品（批號為140853 - 202101，含量98.0%），脫氧果糖嗪對照品（批號為140859-202101，含量95.1%），D- 鹽酸氨基葡萄糖對照品（批號為140649-202007，含量100.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；鹽酸氨基葡萄糖片（A 企業，批號分別為210503，210914，211102，220137，220326，220622，規格均為每片0.75 g）；鹽酸氨基葡萄糖原料（B 企業，批號為211101）；乙腈、庚烷磺酸鈉均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18柱（150 mm×4.6 mm，3μm）；流動相：0.05%庚烷磺酸鈉溶液（取庚烷磺酸鈉0.5 g，加水溶解，加磷酸0.5 mL和1 mol/L氫氧化鉀4 mL，加水至1 000 mL）-乙腈（20∶1，V/V）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：195 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

系統適用性溶液：取果糖嗪、脫氧果糖嗪、D-鹽酸氨基葡萄糖對照品各適量，加水溶解并稀釋制成每1 mL 中約含果糖嗪、脫氧果糖嗪各10μg 和D-鹽酸氨基葡萄糖10 mg的混合溶液。

混合對照品溶液：取果糖嗪、脫氧果糖嗪對照品各適量，精密稱定，分別加水溶解并稀釋，制成每1 mL 中分別含0.461 6 mg，0.492 6 mg 的單一對照品溶液。分別精密量取適量，用水稀釋制成每1 mL 中分別含2.308μg和9.852μg的混合對照品溶液。

供試品溶液：取樣品10片，除去包衣，研細，取適量（約相當于鹽酸氨基葡萄糖500 mg），置50 mL 容量瓶中，加水約40 mL，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理10 min，加水定容，搖勻，靜置5 min，取上清液，經0.22μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

空白輔料溶液：分別稱取片劑處方量的混合輔料（微晶纖維素、低取代羥丙纖維素、羥丙甲纖維素、玉米淀粉、硬脂酸鎂）適量，置50 mL 容量瓶中，再按供試品溶液制備方法制備，即得。

氯離子（Cl-）溶液：取氯化鈉20 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，即得。

空白溶劑：以水為空白溶劑。

2.3 方法學考察

系統適用性與專屬性試驗：取上述系統適用性溶液、混合對照品溶液、供試品溶液、Cl-溶液、空白輔料溶液、空白溶劑各10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果系統適用性溶液中各色譜峰間均分離良好，供試品溶液中果糖嗪、脫氧果糖嗪與相鄰峰之間分離度均大于2.0，Cl-溶液、空白輔料溶液和空白溶劑在與混合對照品溶液保留時間相同處均無干擾峰，表明方法專屬性良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.2項下單一對照品溶液適量，用水稀釋制成每1 mL 分別含果糖嗪9.232，4.616，1.846，0.923，0.462，0.185 μg 及脫氧果糖嗪49.262，24.631，9.852，4.926，2.463，0.985 μg 的系列混合對照品溶液。取適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得果糖嗪回歸方程Y1=14.126X1+0.113 6（r=0.999 8），脫氧果糖嗪回歸方程Y2=14.181X2+1.470 4（r=0.999 9）。結果表明，果糖嗪及脫氧果糖嗪質量濃度分別在0.18～9.23 μg/ mL 及0.98～49.26 μg/ mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

定量限和檢測限考察：取線性關系考察項下最低質量濃度混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以信噪比為10∶1、3∶1 時的待測成分進樣量分別記作定量限、檢測限。結果果糖嗪、脫氧果糖嗪的定量限分別為0.92，0.99 ng，檢測限分別為0.37，0.33 ng。

精密度試驗：取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果果糖嗪、脫氧果糖嗪峰面積的RSD分別為0.53%及0.17%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液（樣品批號為210503）適量，分別于室溫下放置0，4，8，12，18，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果果糖嗪、脫氧果糖嗪峰面積的RSD分別為0.64%，0.21%（n= 6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為210503）細粉適量，各6 份，精密稱定，分別按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果果糖嗪、脫氧果糖嗪平均含量分別為238.01，796.28 μg/ g，RSD分別為1.33%，0.83%（n= 6），表明方法重復性良好。

回收試驗：按處方比例稱取鹽酸氨基葡萄糖原料和混合輔料各適量，共9 份，分別置50 mL 容量瓶中，各精密加入果糖嗪單一對照品溶液0.4，0.5，0.6 mL和脫氧果糖嗪單一對照品溶液0.8，1.0，1.2 mL，平行3 份，制成模擬樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結果見表1。

2.4 樣品雜質含量測定

取6 批樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，平行測定3 次，記錄峰面積并計算樣品中果糖嗪、脫氧果糖嗪含量及相對鹽酸氨基葡萄糖標示量的百分含量，結果見表2。

表2 樣品中2種雜質含量測定結果（n=3）Tab.2 Results of content determination of two impurities in the samples（n=3）

2.5 吡嗪類雜質形成影響因素考察

溫度影響試驗：取樣品（批號為220622）細粉適量，各4 份，置稱量瓶中平鋪，加蓋密封后，分別置50，60，70，80 ℃恒溫箱中放置9 h，每隔1 h 取細粉適量（約相當于鹽酸氨基葡萄糖500 mg），精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖并計算含量。4 種溫度下2 種雜質的含量-時間曲線見圖2。結果顯示，隨著加熱溫度的升高，2 種雜質含量均逐漸增加，其中80 ℃時果糖嗪、脫氧果糖嗪最高含量分別為起始含量（0 h）的1.5 倍、3.7 倍，表明脫氧果糖嗪形成對溫度的依賴性明顯高于果糖嗪。

圖2 不同溫度下2種雜質的含量-時間曲線Fig.2 Content-time curves of two impurities at different temperatures

濕度影響試驗：取樣品（批號為220622）細粉適量，各3 份，置培養皿中，于40 ℃，相對濕度（RH）分別為60%，75%，92%的恒溫恒濕條件下放置7 d，每隔1 d 取細粉適量（約相當于鹽酸氨基葡萄糖500 mg），精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖并計算含量。3種RH 條件下2 種雜質的含量（按扣除水分后的干燥品計）-時間曲線見圖3。結果顯示，隨著RH的升高，2種雜質含量均逐漸增加，且高RH 對果糖嗪形成的影響遠大于脫氧果糖嗪。不同RH 下，2 種雜質的形成量與時間均呈正相關，其變化規律采用零級動力學模型進行分析，計算公式為：Ct=C0+k0·t。式中，Ct為雜質在時間t的含量（μg/g）；C0為雜質的起始含量（μg/g）；t為反應時間（d）；k0為反應速率常數。用Excel 2016軟件對2種雜質第1～7天的含量數據進行擬合，得到不同RH 下雜質含量-時間曲線擬合方程，詳見表3。結果顯示，除92%RH下果糖嗪形成初始反應較劇烈，線性擬合得到的R2較小外，其余R2均超過0.98，數據線性擬合度較高，符合零級動力學模型要求，擬合結果能很好地描述不同RH下2種雜質含量隨時間變化的規律，顯示RH 和時間是影響鹽酸氨基葡萄糖片中果糖嗪、脫氧果糖嗪形成的重要因素。尤其是果糖嗪，在92%RH 時的最高含量約為60%RH、75%RH條件下的10 倍，而脫氧果糖嗪僅約1.6 倍，表明果糖嗪的形成對濕度的依賴性明顯高于后者。

表3 不同相對濕度下2種雜質的含量-時間曲線擬合方程Tab.3 Fitting equation of content - time curves of two impurities at different RH

圖3 不同相對濕度下2種雜質的含量-時間曲線Fig.3 Content - time curves of two impurities at different RH

3 討論

3.1 溶劑選擇

鹽酸氨基葡萄糖制劑有關物質檢查方法中供試品溶液制備溶劑的選擇，現有標準及相關文獻報道的有乙腈-水（1∶1，V/V）、本研究中的流動相、純水。預試驗中2 種對照品在3 種溶劑中均有良好的穩定性，24 h 內峰面積的RSD均小于0.70%；樣品中脫氧果糖嗪在3種溶劑中穩定性均較好，RSD均小于0.78%，而果糖嗪在純水中峰面積的RSD為0.82%，在流動相中為1.50%，在乙腈-水（1∶1，V/V）中峰面積則逐漸增大，RSD達到5.54%，顯示供試液中果糖嗪在純水中最穩定，而在乙腈-水（1∶1，V/V）溶劑中則呈動態變化趨勢，穩定性較差。考慮到果糖嗪和脫氧果糖嗪均具有高水溶性，且在本研究中色譜條件下，超純水峰與目標峰分離良好，故選擇超純水作為供試品溶液制備溶劑。

3.2 不同制劑工藝的影響

項目組調研、收集了國內其他片劑廠家的生產工藝及樣品，發現廠家間生產工藝差異較大，檢測結果也表明不同廠家產品中果糖嗪、脫氧果糖嗪含量差異明顯。本研究中所用樣品制粒工藝采用濕法制粒，另外1家廠家采用干法制粒，測定4 批次干法制粒樣品中2 種雜質含量，結果果糖嗪均未檢出，脫氧果糖嗪平均含量僅為86.33μg/g，可見，不同制劑工藝對2 種雜質形成影響較大，表明果糖嗪、脫氧果糖嗪作為氨基葡萄糖美拉德反應產物，其形成量與制劑工藝密切相關。

在濕法制粒工藝過程中，涉及顆粒水分、制粒時間、干燥溫度、干燥時間等參數控制，項目組對不同濕度條件下2種雜質含量與時間相關性考察時，同步測定了全部時間點樣品水分，結果顯示，在60%或75% RH條件下，水分含量變化不明顯，均在1.57%～2.38%之間；而在92%RH條件下，樣品水分則從1.63%（第0天）升至11.82%（第7 天），扣除水分后的果糖嗪含量也隨之從178.14 μg/ g 增至1 876.20 μg/ g，脫氧果糖嗪從308.45 μg/ g 增至956.21 μg/ g，從2 種雜質含量增幅可見，果糖嗪形成速率與RH 的相關性遠大于脫氧果糖嗪。同時，濕法制粒后，需對藥物顆粒進行干燥處理，因此干燥溫度、干燥時間也可直接影響產品中2種雜質含量。本研究中，果糖嗪含量在加熱第1 h 時呈快速上升趨勢，顯示不同溫度下均存在快速形成誘導期。脫氧果糖嗪則僅在70 ℃及80 ℃時存在快速形成誘導期，2 種雜質形成規律略有區別。在80 ℃高溫條件下，2 種雜質含量在3 h 左右達到峰值，而后隨時間的延長均呈逐漸下降的趨勢，這與文獻［13］報道的加熱時間對食品美拉德反應中吡嗪類產物影響具有的普遍性規律相吻合。另外，從2種雜質含量增幅可見，脫氧果糖嗪的形成與溫度相關性大于果糖嗪。綜上，僅從鹽酸氨基葡萄糖片有關物質控制角度分析，干法制粒工藝優于濕法制粒，但作為治療藥物還應兼顧其臨床有效性，故為減少濕法制粒工藝中產生的吡嗪類雜質，生產廠家有必要對工藝條件開展更科學、合理的設計，建議廠家在濕法制粒環節中，對顆粒水分、制粒時間、干燥溫度、干燥時間等關鍵工藝參數進行綜合優選，以期在不影響療效的前提下，有效降低出廠產品中吡嗪類雜質含量。此外，影響氨基葡萄糖美拉德反應的因素較復雜，不同廠家產品使用的輔料不同，氨基葡萄糖和輔料間化學特性的相容性也可能影響吡嗪類雜質形成速率，對輔料的優選有待進一步探索和研究。

3.3 不同劑型的影響

項目組采用本研究中建立的吡嗪類雜質測定方法分別測定某企業3批次顆粒樣品中果糖嗪和脫氧果糖嗪含量，結果果糖嗪含量（按鹽酸氨基葡萄糖標示量的百分含量計）平均值為0.26%，明顯高于片劑，已超國內已有標準中規定的單個雜質不得過0.1%的限度要求，而脫氧果糖嗪則均未檢出，表明不同劑型2種雜質的形成影響因素及規律有顯著差異。分析原因可能與顆粒生產流程中制軟材工藝相較于片劑，其水分含量更高、加工時間更長有密切關系，氨基葡萄糖在高RH條件下長時間暴露加速了果糖嗪的形成，這也進一步驗證了本研究中的濕度影響試驗中闡述的果糖嗪形成對濕度具有更高依賴性的結論。目前，鹽酸氨基葡萄糖顆粒質量標準中尚未收載有關物質檢查項，基于顆粒工藝特性所致的果糖嗪含量較高的問題，生產廠家有必要對相關生產工藝進行優化和改進，并在質量標準中增訂有關物質檢查項。

3.4 方法評價

本研究中所建立的方法操作簡便、結果準確，精密度、穩定性、重復性均較好，可用于鹽酸氨基葡萄糖片中吡嗪類雜質的含量測定。高溫、高濕條件分別對制劑中脫氧果糖嗪、果糖嗪形成影響較大。表明對于包含濕法制粒工藝步驟的氨基葡萄糖制劑，對吡嗪類雜質的控制是其整體質量控制中不可忽視的一部分，生產廠家有必要通過制粒和干燥工藝參數的多因素綜合優化，尋求最優工藝條件，最大限度地抑制該類雜質的形成。