紅景天對急性髓系白血病潛在治療作用機制的網絡藥理學研究*

紀穎慧，丁傳華，唐琳琳，劉文山

（濰坊醫學院附屬醫院，山東 濰坊 261031）

急性髓系白血?。ˋML）為造血系統惡性腫瘤，當病情發展時，異常原始細胞和幼稚細胞會大量增殖并干擾正常的造血過程，同時還會侵襲和浸潤肝、脾、淋巴結等多個器官。中醫古籍中無AML 病名的記載，根據該病的發病特點和臨床表現，現多將其歸為“溫病”“虛勞”“血證”“痰核”等范疇，總病機為正虛邪實、虛實夾雜［1］。現階段，化學藥物治療仍是AML 治療的主要方法。紅景天有益氣活血、通脈平喘功效，主治氣虛血瘀，胸痹心痛、中風偏癱、倦怠氣喘［2］?，F代藥理學研究證明，紅景天具有抗癌、保護心腦血管、抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡、抗疲勞和抗抑郁等諸多功效［3］，臨床廣泛用于抗腫瘤、防治缺血性腦卒中和多種心肝肺等臟器疾病。但目前紅景天用于防治AML 的相關報道較少，且其作用機制尚未明晰。本研究中通過網絡藥理學和分子對接技術探討紅景天治療AML 的潛在藥理學作用機制，以期為臨床治療AML 提供新的用藥思路，并為后續的新藥研發提供參考。

1 資料與方法

1.1 紅景天有效成分及作用靶點篩選

通過檢索中醫藥整合藥理學研究平臺（TCMIP）、本草組鑒平臺（HERB，http：//drug.ac.cn/）及相關文獻，收集紅景天的有效成分，并導入PubChem 數據庫，（https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索化合物結構。利用SwissADME數據庫（http：//www.swissadme.ch/）對化合物結構進行分析與篩選，設置篩選條件為：藥物代謝動力學（簡稱藥動學）模塊中胃腸吸收為高，類藥性（DL）模塊中5 個過濾條件（Lipinski，Ghose，Veber，Egan，Muegge）中≥2 個條件結果為“Yes”。利用Swiss TargetPrediction 數據庫（http：// www.swisstargetprediction.ch/）對篩選得到的成分進行靶點預測，選擇Probability ≥0.1 的靶點。剔除重復和無化學結構或無作用靶點的藥物成分，最終建立紅景天的有效成分與作用靶點數據庫。

1.2 中藥與疾病共有靶點篩選

利用GeneCards 數據庫（https：// www.genecards.org/）檢索得到AML 疾病相關靶點，選取其中Relevance score>4次中位數評分的靶點，利用Venny 2.1在線平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制中藥與疾病靶點的維恩圖，并獲取兩者的共有靶點。

1.3 蛋白相互作用（PPI）網絡構建及核心靶點篩選

將共有靶點導入String 網站（https：// cn.string -db.org/ ），設置minimum required interaction score =0.400，構建PPI網絡，并以tsv格式導入Cytoscape 3.8.1軟件進行可視化處理。利用CytoNCA 插件分析PPI 網絡，篩選節點度值（degree）≥55的靶點為核心靶點。

1.4 富集分析

將共有靶點輸入DAVID 數據庫進行基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，獲取共有靶點的生物學信息。兩者均選取P<0.01的結果進行分析。通過微生信在線平臺（http：// www.bioinformatics.com.cn）對其結果進行可視化分析。

1.5 中藥-成分-共有靶點-通路-疾病網絡構建

選擇KEGG 分析結果中富集基因數量排名前10 的信號通路，與紅景天的有效成分、共有靶點相結合，導入Cytoscape 3.8.1軟件，構建中藥-成分-共有靶點-通路-疾病網絡。分析紅景天作用于AML 的有效成分及通路。

1.6 分子對接驗證

將核心靶點與其對應的紅景天有效成分進行分子對接。結合能越低，則配體與受體結合的穩定性越高［4］。將有效成分化合物結構輸入Chem3D軟件進行自由能最小化處理。利用PDB數據庫（https：//www.rcsb.org/）下載核心靶點的蛋白結構。將靶點蛋白結構導入PyMOL軟件去除水分子和小分子配體，利用AutoDock Tools 軟件為靶點蛋白加氫并建立活性口袋。將處理后的化合物分子與靶點蛋白結構導入AutoDock Vina 軟件進行分子對接，評價兩者的結合活性，選取各靶點對接全部結果中結合能絕對值最高的一組（若多組并列最高，則隨機選取其中一組），并用PyMOL軟件對其可視化分析。

2 結果

2.1 紅景天的有效成分及作用靶點

初步得到紅景天有效成分160個，其中TCMIP平臺7 個、HERB 平臺26 個、文獻［5-6］127 個。最終獲得紅景天有效成分34個，作用靶點336個。

2.2 中藥-疾病共有靶點

初步得到AML 疾病相關靶點13 993 個，最終獲得AML疾病相關靶點874個，并得到中藥-疾病共有靶點81個（見圖1）。

圖1 紅景天與急性髓系白血病靶點維恩圖Fig.1 Venn diagram of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma and AML - related targets

通過共有靶點，得到與AML靶點相關中藥有效成分22個，主要包括kaempferol（山柰酚）、quercetin（槲皮素）、borneol（冰片）、tricin（麥黃酮）、velutin（氈毛美洲茶素）、tamarixetin（檉柳素）、herbacetin（草質素）、7-hydroxycoumarin（7-羥基香豆素）、gallic acid（沒食子酸）等。

2.3 PPI 網絡及核心靶點

中藥-疾病共有靶點PPI網絡見圖2。PPI網絡可視化分析圖見圖3，degree 排名前5 的核心靶點分別為GAPDH（degree = 67）、TP53（degree = 66）、AKT1（degree=64）、VEGFA（degree=58）、EGFR（degree=55）。

圖2 中藥-疾病共有靶點PPI網絡Fig.2 PPI network of common targets of traditional Chinese medicine-disease

圖3 中藥-疾病共有靶點PPI網絡可視化分析圖譜Fig.3 Visual analysis of common target PPI of traditional Chinese medicine-disease

2.4 富集分析

GO分析：共獲得209項生物學過程（BP），主要包括凋亡過程負向調控、信號轉導、細胞增殖正向調控、蛋白磷酸化等；56 項分子功能（MF），主要包括蛋白結合、三磷酸腺苷（ATP）結合、蛋白同型二聚化活性、蛋白激酶活性等；36項細胞組分（CC），主要包括細胞質、胞質液、細胞核、細胞膜、胞外區等。分別選取靶點蛋白富集數量排名前10的富集結果繪制柱狀圖（見圖4 A）。

圖4 富集分析結果Fig.4 Results of enrichment analysis

KEGG 分析：共得到信號通路101 條。以靶點蛋白富集數量排名前30的富集結果繪制氣泡圖（見圖4 B）。其中靶蛋白富集數量排名前10 的信號通路為癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、人乳頭瘤病毒感染、癌癥中的微小RNA（miRNA）、癌癥中的蛋白聚糖、Rap1 信號通路、細胞衰老、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、Ras信號通路等。

2.5 中藥-成分-共有靶點-通路-疾病網絡相應網絡見圖5。

圖5 中藥-成分-共有靶點-通路-疾病網絡Fig.5 Network of traditional Chinese medicines-ingredients-common targets-pathways-disease

2.6 分子對接驗證

將核心靶點GAPDH，TP53，AKT1，VEGFA，EGFR與其對應中藥有效成分進行分子對接。結合能均不超過-4.80 kcal/mol（見表1），提示藥物成分與靶點之間具有良好的親和力（結合能<0 kcal/mol提示具有親和力）。分子對接可視化分析結果見圖6。

表1 分子對接結果Tab.1 Results of molecular docking

圖6 分子對接展示圖Fig.6 Display of molecular docking

3 討論

本研究結果顯示，紅景天核心有效成分主要包括山柰酚、槲皮素、草質素、檉柳素、氈毛美洲茶素、麥黃酮等，其在紅景天對AML 的藥理機制中有重要作用，這與既往研究結果基本一致［6］。槲皮素為黃酮類化合物，可通過降低體內炎性因子的表達抑制炎性反應，且具有抗氧化和神經保護作用［7］。有研究表明，槲皮素能抑制細胞增殖并誘導鐵死亡，進而導致細胞凋亡［8］。山柰酚為有抗腫瘤作用的類黃酮，可通過誘導腫瘤細胞凋亡、細胞周期阻滯和自噬等作用來抑制腫瘤組織生長［9］。張琴［10］通過細胞實驗發現，山柰酚能顯著抑制人肝癌細胞HepG2的增殖，且抑制效果隨藥物濃度增大而增強。草質素為黃酮類化合物，主要存在于紅景天、棉花等植物中，在清除自由基及防止蛋白氧化方面具有顯著作用［11］。紅景天有效成分具有抗腫瘤、抑制細胞增殖、抑制炎性反應等作用，這為其防治AML提供了可能的理論基礎。值得注意的是，紅景天苷也是紅景天的主要活性成分之一，其藥理作用也是近年來的研究熱點［12］。但本研究中的潛在有效成分中無紅景天苷，不排除與部分數據庫的更新滯后或紅景天苷的首過效應有關。

在中藥-疾病共同靶點的PPI網絡中，degree排名前5的核心靶點在紅景天防治AML 的潛在作用機制中均有重要作用。其中，GAPDH 為糖酵解酶，在人體糖代謝過程中起關鍵作用，幾乎在所有細胞中均有表達，且參與非糖酵解過程，如細胞凋亡、腫瘤形成、DNA 修復、細胞膜融合等［13］。VEGFA 是血管內皮生長因子（VEGF）的家族成員之一，與血管生成關系密切，在AML 的發生發展過程中起重要作用［14］。TP53 是人類癌癥中最常見的突變基因，在癌癥發生、細胞衰老、DNA 修復等基本生物學過程中具有核心作用，被認為與AML 的發生發展關系密切［15］。此外，本研究中核心靶點與相應的紅景天有效成分的分子對接結合能結果提示，靶點蛋白與藥物有效成分之間親和力較好，結合較穩定。

本研究結果顯示，中藥- 疾病共有靶點所作用的CC更多地集中于細胞質、胞質液、細胞核、細胞膜、胞外區等，通過蛋白結合、ATP 結合、蛋白同型二聚化活性、蛋白激酶活性等MF，實現對細胞凋亡過程負向調控、信號轉導、細胞增殖正向調控、蛋白磷酸化等BP發揮調節作用。本研究結果表明，此過程可能是紅景天對AML潛在療效的生物學機制。與中藥- 疾病共有靶點相關的信號通路主要包括PI3K - Akt 信號通路、癌癥中的miRNA 等。PI3K-Akt通路與調節細胞增殖、生長、代謝和運動等過程有關，研究表明，該通路在人類癌癥發生發展中普遍被激活，該通路的抑制可促進人體腫瘤消退［16］。有研究發現，通過影響miRNA 的表達量可靶向調節細胞增殖和凋亡信號通路，這可能為腫瘤治療提供了新思路［17］。

綜上所述，本研究中通過網絡藥理學和分子對接技術初步預測了紅景天治療AML 的潛在藥理學作用機制。紅景天的主要有效成分包括山柰酚、槲皮素、草質素、檉柳素、氈毛美洲茶素、麥黃酮等，通過與核心靶點GAPDH、TP53、AKT1、VEGFA、EGFR 等的良好結合，作用于PI3K-Akt、癌癥中的微小RNA 等信號通路，從而發揮對AML 的潛在療效。這提示紅景天治療AML 可能是一個“多成分、多靶點、多通路”的過程，也為今后臨床靈活運用紅景天治療AML提供理論依據。