肉湯紙片洗脫法和全自動藥敏系統應用于黏菌素藥敏試驗的方法學評價*

周春妹,黃嘉儀,黃聲雷,馬 艷,單玉璋,沈佳瑾,王蓓麗,潘柏申,郭 瑋

復旦大學附屬中山醫院檢驗科,上海 200032

黏菌素是從多黏桿菌中分離的一種多肽類殺菌劑,其殺菌機制是通過分子中的聚陽離子環與革蘭陰性桿菌細胞膜上的磷酸基結合,使細胞膜通透性增加,從而導致細胞內的嘌呤、嘧啶等小分子物質外漏,最終使細菌膨脹、溶解、死亡[1]。由于存在腎毒性和神經毒性等嚴重藥物不良反應,黏菌素一度在臨床上被停止使用[2]。但近幾年隨著多重耐藥甚至泛耐藥的革蘭陰性桿菌感染比例不斷升高,如何遏制耐藥革蘭陰性菌的傳播并合理使用抗菌藥物提高抗感染治療成功率成為臨床亟須解決的問題[3]。黏菌素類抗菌藥物作為少數幾種對泛耐藥的革蘭陰性桿菌保持較好體外抗菌活性的藥物之一,在2017年被國家食品藥品監督管理總局批準重新用于抗感染治療[4]。由于黏菌素中陽性離子團與瓊脂的靜電相互作用使其不易溶于瓊脂,難以在瓊脂內擴散,導致擴散方法的準確性較差[5],因此2016年歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會(EUCAST)和美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)聯合聲明不推薦使用瓊脂稀釋法、紙片擴散法和濃度梯度擴散法用于常規檢測黏菌素類藥物的敏感性,并建議臨床實驗室使用微量肉湯稀釋法(BMD)。為了減少實驗室成本和方便操作,2020年CLSI又推出了黏菌素肉湯紙片洗脫法(CBDE)作為檢測革蘭陰性桿菌對黏菌素敏感性的方法。本研究評估了CBDE和自動化藥敏系統與參考方法BMD檢測革蘭陰性桿菌對黏菌素藥敏結果的一致性,現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2021年1-6月本院臨床標本分離的非重復黏菌素耐藥菌株和隨機選取等量的敏感菌株共133株革蘭陰性桿菌,其中大腸埃希菌67株、肺炎克雷伯菌66株。本研究獲得本院醫學倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀、Vitek CompactⅡ全自動藥敏分析儀和AST-GN335藥敏卡購自法國生物梅里埃公司;Phoenix M50全自動藥敏分析系統及Phoenix NMIC-413藥敏卡購自美國BD公司;黏菌素紙片(10微克/片)、陽離子調節肉湯(CAMHB)、BMD-96孔板(測定濃度為0.06～32 mg/L)均購自溫州康泰生物科技有限公司。藥敏試驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸埃希菌MCR-1陽性NCTC13846,以上菌株均購自上海市臨床檢驗中心。

1.3方法

1.3.1CBDE和BMD CBDE根據 CLSI M100-S30文件推薦操作進行。具體做法如下:將CAMHB試管和黏菌素紙片恢復至室溫。在含有10 mL CAMHB試管中加入不同數量的黏菌素紙片,以制作含0 μg/mL(不放紙片)、1 μg/mL(加1個紙片)、2 μg/mL(加2個紙片)和4 μg/mL(加4個紙片)最終黏菌素濃度的肉湯。將加入紙片的試管在室溫下輕輕漩渦振蕩洗脫30～60 min。在10 mL管中加入50 μL 0.5麥氏濁度的菌懸液,使最終接種濃度為7.5×105CFU/mL。用10 μL接種環取原始接種物至血平板上純培養。加入紙片的CAMHB試管在低速下短暫渦旋,混勻,防止黏菌素黏附于蓋子或液面上方的玻璃表面。輕輕松開蓋子,將試管和平板在35 ℃的環境中孵育16～20 h后,記錄最低抑菌濃度(MIC)。BMD具體操作如下:黏菌素微量肉湯稀釋板和CAMHB試管恢復至室溫。200 μL CAMHB試管中加入10 μL的0.5麥氏濁度受試菌懸液,然后取100 μL加入黏菌素微量肉湯稀釋板孔內。在35 ℃的環境中孵育16～20 h后,記錄MIC。黏菌素的判斷標準根據EUCAST的折點表10.0版進行解釋,即MIC≤2 mg/L判為敏感,MIC >2 mg/L判為耐藥。為了保證測試菌的同質性,同一株待測菌的所有測試均在同一天進行。

1.3.2細菌鑒定和全自動藥物敏感性試驗 使用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀將分離菌鑒定到種。分別使用Vitek CompactⅡ全自動藥敏分析儀及AST-GN335藥敏卡(黏菌素檢測濃度為0.5～16 mg/L)和Phoenix M50全自動藥敏分析系統及Phoenix NMIC-413藥敏卡(黏菌素檢測濃度為1～4 mg/L)進行黏菌素的藥敏試驗。具體操作步驟參考廠家的說明書。

1.4觀察指標 根據我國2018年發布的WS/T639—2018《抗菌藥物敏感性試驗的技術要求》,以BMD為本研究參考方法,評估方法學的指標如下:(1)基本一致性(EA)。EA是指被評估方法檢測MIC與BMD的MIC值之間相差±1個稀釋度的菌株百分比。(2)分類一致性(CA)。CA是指按照藥物敏感性折點標準判讀為敏感和耐藥一致的菌株百分比。(3)重大誤差(ME)。ME是指菌株在同一折點判斷標準下,被評估方法將敏感判定為耐藥的百分比(即假耐藥率,分母是參考方法檢測出的敏感菌株數)。(4)非常重大誤差(VME)。VME是指菌株在同一折點判斷標準下,被評估方法將耐藥判定為敏感的百分比(即假敏感率,分母是參考方法檢測出的耐藥菌株數)。當CA和EA均≥90%且所有耐藥菌株的VME以及所有敏感菌株的ME均≤3%時,作為評估方法的可接受標準。

1.5統計學處理 采用SPSS 23.0軟件進行數據處理。計數資料以例數或百分率表示,對3種方法檢測結果與BMD結果的一致性分析使用Kappa檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1BMD檢測黏菌素的結果 BMD檢測133株菌株對黏菌素的耐藥率為39.8%(53/133),MIC50為1 μg/mL,MIC90為64 μg/mL。其中大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對黏菌素的耐藥率分別為10.4%(7/67)和69.7%(46/66)。BMD檢測黏菌素MIC的分布見表1。

表1 BMD檢測黏菌素MIC的分布

2.2CBDE檢測黏菌素的結果以及與BMD結果比較 使用CBDE檢測,133株菌株對黏菌素的耐藥率為39.8%(53/133),MIC50為≤1 μg/mL,MIC90為>4 μg/mL。其中大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對黏菌素的耐藥率分別為10.4%(7/67)和69.7%(46/66)。CBDE和BMD結果比較:CBDE檢測大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌總體的EA為97.7%,CA為100.0%,ME和VME均為0.0%。見表2。

表2 CBDE檢測黏菌素的結果及與BMD比較

2.3Phoenix NMIC-413檢測黏菌素的結果以及與BMD結果比較 使用Phoenix NMIC-413藥敏卡檢測,133株菌株對黏菌素的耐藥率為34.6%(46/133),MIC50為≤1 μg/mL,MIC90為>4 μg/mL。其中大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對黏菌素的耐藥率分別為7.5%(5/67)和62.1%(41/66)。與BMD結果比較,NMIC-413藥敏卡檢測大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌總體的EA和CA均為94.7%,ME為0.0%,VME為13.2%。見表3。

表3 PhoenixNMIC-413檢測黏菌素的結果及與BMD比較

2.4Vitek CompactⅡ-GN335檢測黏菌素的結果以及與BMD結果比較 使用Vitek CompactⅡ-GN335藥敏卡檢測,133株菌株對黏菌素的耐藥率為35.3%(47/133),MIC50為≤0.5 μg/mL,MIC90為≥16.0 μg/mL。其中大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對黏菌素的耐藥率分別為8.9%(6/67)和62.1%(41/66)。與BMD結果比較,Vitek CompactⅡ-GN335藥敏卡檢測大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌總體的EA和CA均為95.5%,ME為0.0%,VME為11.3%。見表4。

表4 VitekCompactⅡ-GN335檢測黏菌素的結果及與BMD比較

2.5一致性分析 CBDE、Phoenix NMIC-413和Vitek CompactⅡ-GN335檢測大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對黏菌素敏感性的結果與BMD的檢測一致性分析顯示,Kappa值分別為1.000(P=0.000 1)、0.888(P=0.000 1)和0.904(P=0.000 1)。

3 討 論

2017年世界衛生組織把耐碳青霉烯類的革蘭陰性菌列為全球耐藥的緊急威脅,并將研發針對性抗菌藥物列為最高優先等級。黏菌素作為“老藥新用”的代表已成為目前臨床對抗耐碳青霉烯類的革蘭陰性菌重要“武器”之一[6]。隨著黏菌素在臨床的使用量不斷增加,其耐藥率也逐年上升[7],這要求微生物實驗室需提供快速并準確的黏菌素藥敏結果以滿足臨床合理使用抗菌藥物的要求。為了應對這種情況,EUCAST/CLSI指南均添加了黏菌素類的藥敏檢測方法和對應判讀折點,且每年都進行更新。EUCAST和CLSI目前首選推薦使用BMD進行多黏菌素B和黏菌素的藥敏試驗。但是由于BMD相較于紙片法以及商品化全自動藥敏系統,操作煩瑣且成本較高,限制了其在微生物實驗室常規工作中的廣泛使用。國外學者HUMPHRIES等[8]在2019年對CBDE進行了評估,共檢測了498株革蘭陰性桿菌(包括腸桿菌目細菌270株、銅綠假單胞菌122株和鮑曼不動桿菌106株),總體上94.4%CBDE的MIC值與參考方法BMD的MIC值基本一致,97.9%CBDE的判讀結果與參考方法BMD的判讀結果分類一致;498株細菌CBDE檢測的VME和ME分別為3.2%和0.9%,其中腸桿菌目細菌CBDE檢測的CA為98.6%、VME為2.5%、ME為0%,銅綠假單胞菌檢測CBDE的CA為99.3%、VME為0%、ME為0.7%,不動桿菌檢測CBDE的CA為93.1%、VME為5.6%、ME為3.3%。正是基于這個研究數據,2020年CLSI批準了CBDE成為檢測腸桿菌目細菌和銅綠假單胞菌的黏菌素體外敏感性的試驗方法,但是目前國內有關CBDE的研究報道較少。

本研究為了驗證CBDE方法的準確性,共檢測了133株腸桿菌目細菌。研究結果發現,97.7%CBDE的MIC值和參考方法BMD的MIC值基本一致,只有3株細菌(1株大腸埃希菌和2株肺炎克雷伯菌)的兩個方法的MIC值相差大于1個稀釋度。在判讀結果分類一致性上,CBDE的判讀結果與參考方法BMD的結果100.0%相同。國內學者黃麗等[9]對CBDE的研究結果顯示,CBDE 檢測腸桿菌目細菌對黏菌素敏感性的 EA為90.3%、CA為99.6%、ME為0.4%、VME為0%,CBDE與BMD的結果具有較高的一致性,這和本研究結論相同,并驗證了CLSI的推薦。

2020年《協和醫學雜志》刊登了《多黏菌素藥物敏感性檢測及臨床解讀專家共識》,該共識不常規推薦自動化藥敏檢測儀器用于黏菌素的體外敏感性試驗,自動化藥敏檢測儀器只有經過臨床實驗室性能驗證后,滿足臨床報告需求時才可以使用。目前自動化藥敏檢測儀器是否能用于黏菌素的檢測還存在一些爭議。國內ZHU等[10]研究結果顯示,使用Phoenix NMIC-413藥敏卡檢測136株大腸埃希菌和26株肺炎克雷伯菌對黏菌素的藥物敏感性,結果顯示CA和EA均為100%,ME和VME均為0%。該研究認為NMIC-413藥敏卡可作為臨床實驗室檢測黏菌素敏感性的方法,而使用Vitek CompactⅡ-GN335藥敏卡對這些菌株進行黏菌素敏感性檢測結果顯示與BMD一致性較差,CA分別為89.7%和63.0%,且有較高的VME,分別為26.3%和0%,因此Vitek CompactⅡ-GN335藥敏卡不能作為臨床實驗室檢測黏菌素藥敏的方法。然而PFENNIGWERTH等[11]報道,使用Phoenix檢測206株肺炎克雷伯菌對黏菌素的敏感性,結果顯示存在較高的VME(8%),提示Phoenix儀器法不能為實驗室提供準確的黏菌素藥敏數據。為了更好地了解微生物實驗室使用的自動化藥敏檢測儀器檢測黏菌素藥敏結果的準確性,本次試驗分別評估了Phoenix NMIC-413藥敏卡和Vitek CompactⅡ-GN335藥敏卡,研究結果顯示兩種商品化的藥敏卡與BMD比較,CA和EA均超過95.0%,與參考方法的一致性較好;但是兩種商品化的藥敏卡檢測結果存在一定假敏感率,VME分別為13.2%和11.3%。本研究和劉曉妤等[12]的研究結果相似。本研究存在一些局限性:首先,本次收集的腸桿菌目細菌種類較單一,僅僅包含了大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌;其次,CLSI推薦CBDE也可以檢測銅綠假單胞菌對黏菌素的敏感性,但本研究沒有納入銅綠假單胞菌進行研究。本研究團隊將會在后續的研究工作中擴大測試細菌的種類和數量。

綜上所述,CBDE由于其較低的成本、簡便的操作和準確的結果可以作為臨床微生物實驗室檢測腸桿菌目細菌對黏菌素敏感性的可靠試驗方法。自動化藥敏檢測儀器檢測黏菌素體外藥敏的結果有一定價值,但對于那些由自動化藥敏檢測儀器判讀為敏感的菌株仍需使用BMD進行復核。