罕見抗-M鑒別分析:附1例報道*

鄒 昕,虞 茜,馬思飛,楊紅梅△

1.江蘇省常州市中心血站輸血研究室,江蘇常州 213004;2.江蘇省常州市臨床輸血重點專科實驗室,江蘇常州 213004

MNS血型系統是第2個被發現的血型系統,目前大約包括 50個抗原。抗-M是較常見的“天然抗體”,國內有研究報道,產前抗體篩查中抗-M被列為繼Rh血型系統的第2位常見抗體,大多數抗-M只在低于37 ℃有反應,最適反應溫度為4 ℃[1]。常州市中心血站在獻血者篩查中發現1個特殊案例,血漿中存在一種罕見的抗-M,影響ABO血型鑒定,但這種抗-M不與其自身M抗原陽性紅細胞凝集。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 獻血者,女,30歲,江蘇常州人,漢族,2022年4月12日首次無償獻血,在常州市中心血站檢驗科篩查的過程中發現其ABO血型正定型為B型,反定型為O型,因正反定型不符送EDTA抗凝血和非抗凝血標本到常州市中心血站輸血研究室進行血型鑒定。

1.2儀器與試劑 日本久保田KA-2200血清學專用離心機;上海躍進醫療37 ℃恒溫水浴箱;強生ORTHOTM Workstation離心機。抗-A/B單克隆抗體(批號:20201221)、抗-D(IgM)單克隆抗體(批號:20201201104)、ABO血型反定型紅細胞(批號:20225309)、抗-M和抗-N(批號:20211011、20200709)、2-Me(批號:20217701)、酸放散試劑盒(批號:20212101)均購自上海血液生物公司;抗體篩選細胞和譜細胞(批號:702205、732205)購自德國CE公司;抗人球蛋白卡(批號:AHC228H)購自強生公司;人源抗-M(批號:20220128)自制。

1.3方法

1.3.1血清學檢測 用試管法進行ABO、Rh血型鑒定;用試管法、凝膠卡法進行直接抗球蛋白試驗和不規則抗體篩查;應用譜細胞進行不規則抗體鑒定;用等比稀釋法進行抗體效價檢測。所有試驗嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》[2]及試劑說明書進行操作。

1.3.2吸收放散試驗 用生理鹽水洗滌3次所需壓積細胞1 mL(O型分別為MN型、MM型、NN型紅細胞以及自身紅細胞),均加入等量受檢血清混勻,放入4 ℃冰箱吸收60 min ,其間搖動混勻2～3次,離心去上清液,然后用4 ℃生理鹽水洗滌6次,取第6次洗滌液作為對照,分別加入與紅細胞等量的生理鹽水,56 ℃水浴熱放散10 min,其間搖動混勻2～3次,離心取放散液,挑選相應的譜細胞進行檢測。

1.3.3MN基因測序分析和序列比對 該實驗部分由天津秀鵬公司完成。根據GenBank 的NG-007470基因參照序列,使用Oligo 軟件自行設計GYPA 基因第2外顯子的上、下游引物,進行擴增,PCR產物測序及序列比對。

2 結 果

2.1ABO/MNS血型血清學實驗結果 該獻血者血型正定型為B型,反定型結果顯示血清與A、 B、O細胞均為凝集狀態,但與自身細胞無凝集,紅細胞與單克隆抗-M及人源抗-M反應均有凝集,該獻血者MNS血型見表1。用經篩選出M陰性的Ac、Bc、Oc獻血者紅細胞做反定型,結果為B型。

表1 該獻血者ABO/MNS血型血清學實驗結果

2.2直接抗球蛋白試驗 多特異性抗球蛋白、抗-IgG、抗-C3d均為陰性。

2.3抗體鑒定 該獻血者反定型結果提示其體內有不規則抗體,進一步進行抗體鑒定。其血漿與德國CE譜細胞(批號:732205)反應,在鹽水、聚凝胺、抗球蛋白凝膠卡試管法中結果符合IgM型的抗-M。用酶處理細胞進一步進行抗體鑒定,實驗結果均為陰性。為了排除IgM抗體的干擾,血清與等量的2-Me在37 ℃孵育30 min,繼續抗體鑒定結果均為陰性。

2.4吸收放散試驗 將該獻血者血漿分別用O型的MM、NN型紅細胞以及自身紅細胞吸收;該獻血者的紅細胞用人源抗-M血清吸收,再進行熱放散。放散液與相應的譜細胞(1、3、4號)反應結果見表2。

表2 吸收放散試驗結果

2.5抗體效價測定 用純合子MM型細胞作效價測定,試管法檢測該抗-M效價為16。

2.6MN基因測序分析和序列比對 基因測序GYPA 第2外顯子59位C>T,71位G>A,72位T>G(均為雜合峰)。測序結果顯示標本基因分型結果與血清學分型結果相符為MN型,堿基序列未發現異常突變。特征序列見圖1。

圖1 基因測序GYPA 第2外顯子結果

3 討 論

類同種特異性自身抗體(簡稱類抗體),被認為具有明顯紅細胞同種抗體特異性,又能被該特異性抗原陰性的紅細胞吸收的一類抗體,而真正的同種抗體僅能被抗原陽性的紅細胞吸收[3-5]。通常情況下,紅細胞表面存在相關的抗原,而血漿中不應存在該抗原對應的抗體。該獻血者血清在鹽水介質中檢測出明顯特異性抗-M,自身有M抗原,與自身細胞不凝集,結果相矛盾不符合常理,因此排除類抗-M。有研究表明人類紅細胞MNS血型中抗-M的產生與M抗原是否存在沒有必然關聯,與相關基因GYPA的表達也無明顯關聯[6-7],為了研究這個問題從兩方面著手考慮:(1)該檢測的抗體是否為抗-M;(2)該檢測的抗原是否為M抗原。

筆者又用進口Sanquin(批號:800451970)的16份譜細胞鑒定,再次證實該抗體有抗-M特異性。有文獻報道抗-M1同樣具有抗-M特異性,研究發現早期的抗-M1是在NN個體血清中和抗-M一起被發現的,M1只在M陽性紅細胞上存在,抗原在非洲裔人群中頻率高達24%,而在白種人中頻率為4%[8]。抗-M1也被認為是唯一的特異性,與抗-M不同,但又有交叉反應,在譜細胞上顯示沒有劑量效應,不符合積分規律。本案例中譜細胞凝集強度具有明顯的劑量效應,基本排除該抗體為抗-M1。用吸收放散試驗進一步證明獻血者抗-M能被異體的M抗原陽性的細胞吸收放散,但不能被M抗原陰性和自身細胞吸收放散,且沒有證據表明獻血者體內紅細胞被自身抗體破壞,能排除該抗-M為自身抗體。早期文獻中發現在M抗原陽性的個體血清中鑒定出類抗-M同種抗體,這種抗體與自身細胞不反應,患者的類抗-M和他的MN型孩子的細胞均不反應,與MN型姐妹也不發生反應[9]。鑒于吸收放散試驗結果,該獻血者的血漿不能輸注給M陽性患者,若為受血者,需要輸注交叉配血相合的M陰性血液。

MNS系統本身也是一個復雜的系統,很多抗原能夠發生交叉反應。比如一些單克隆抗-M與He會有交叉反應,但是多克隆抗-M不涉及這種交叉反應問題[8]。因此筆者用人源的抗-M鑒定進一步證實該獻血者為M抗原陽性。MNS血型系統基因多態性的產生機制主要有單核苷酸突變(相關抗原如 S/s、Mit等)、兩個或多個核苷酸突變(如 M/N抗原等)、基因轉換(如 Mia、Mur抗原等)、基因不等位交換[8](如 Hil 抗原等)。該獻血者MN基因測序分析和序列比對結果與血清學分型結果相符為MN型,堿基序列未發現異常突變。還有一種情況由于GYPA和GYPB發生了不等交換產生了變異體GP.Hil表型紅細胞,它不僅是一個表達GP(B-A)血型蛋白的雜交基因,而且其兩側有正常的GYPA和GYPB[10]。這樣的雜交子可以解釋異常的MNS表型。獻血者血清學分型結果為MN型但其凝集強度偏弱,MN基因測序分析和序列比對結果也為MN型。由于實驗條件有限,本案例沒有應用免疫印跡技術進一步鑒定血型糖蛋白,對其蛋白結構是否有變化無法判斷,條件允許的情況下可以做家系調查,同時還應分析該例抗-M與其他人類和單克隆抗-M的性能區別,如不同人的紅細胞M血型檢測、吸收放散試驗,還要檢測吸收后血漿中的抗-M活性。

綜上所述,MNS系統的相應抗原復雜且多樣化,本文報道的該例獻血者紅細胞上既有M抗原,血清中又檢出抗-M,因此將血型血清學和分子生物學方法相結合才能更準確地鑒定標本。該獻血者血漿中存在一種罕見的抗-M,這種抗-M不與M抗原陽性的自身紅細胞凝集,但與異體M陽性紅細胞反應,其血漿不能輸注給M陽性的患者,患者輸血時應該選擇交叉配血相容的M陰性紅細胞。