雞血藤復方提取物對C57小鼠Lewis肺癌實體瘤抑制作用

鐘春燕 何宇鴻 李元樞 葉玨穎 何阮瀅 曹穎男

(廣州新華學院藥學院,廣東 廣州 510520)

非小細胞肺癌(NSCLC)發生發展與體內特定促癌基因活性增強或抑癌基因活性降低、微環境持續致損、慢性炎癥、缺氧、酸性態等因素有關。中醫理論認為癌癥的發生發展主要是由于正氣虛損、陰陽失衡,致使氣滯血瘀、痰凝毒聚導致的〔1〕,治療上以扶正袪邪為主,如益氣、養血、滋陰、溫陽,輔以軟堅散結、活血化瘀、化痰利濕、清熱解毒等療法,實現標本兼治〔2〕。雞血藤是一種傳統的活血補血中藥,具有活血補血、調經止痛、舒筋活絡的功效,為豆科植物密花豆的干燥藤莖〔3〕,其所含化學成分有黃酮、酚、木脂素、甾醇及揮發油等,其除了活血、促進造血的功效外,其還有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多樣藥理學活性〔4～8〕。雞血藤的黃酮類組分和縮合鞣質對腫瘤細胞有明顯的抑制作用〔9～12〕,該藥主要通過細胞凋亡和自噬、腫瘤細胞周期阻滯和抑制腫瘤轉移發揮抗腫瘤作用〔13〕。本實驗對雞血藤復方提取物進行抗腫瘤及免疫調節初步驗證,為進一步開發應用中藥抗腫瘤價值提供藥理學依據。

1 材料與方法

1.1材料及動物 lewis肺癌細胞株(中國科學院細胞庫/干細胞庫),復蘇培養,以107/只接種于C57小鼠腋下用于試驗。50只SPF級雄性健康C57小鼠,購入時4周齡。體質量18～20 g,購自中山大學實驗動物中心東校區,實驗動物合格證號為:NO.44008500014488。實驗動物使用許可證號:SYXK(粵)2016-0112,飼養于中山大學實驗動物中心SPF級屏障環境動物房,溫度20～25 ℃,濕度40%～70%,換氣次數>10次/h,飼養密度:5只/籠,照明時間:12 h,自由攝食飲水〔飼料,生產單位:廣東省醫學實驗動物中心,生產許可證:SCXK(粵)2008-0002〕。

1.2藥材 在前期研究基礎上〔14〕根據君臣佐使進一步優化,得到中藥復方:雞血藤20 g(批號2002003),柴胡15 g(批號2002002),蚤休15 g(批號2002006),莪術15 g(批號2004062),蜈蚣10 g(批號2002008),黃芪30 g(批號2002021),均購自清遠醫農坤載大藥房有限公司。藥材粉碎,稱重,第1次提取:將稱好的藥材置于圓底燒瓶中,加入10倍的水進行回流提取2 h(沸騰才開始計時),同時收集揮發油,用二層100目紗布進行過濾。第2次提取:往濾渣中加入8倍量的水進行提取,時間為1.5 h(沸騰才開始計時),同時收集揮發油,二層100目紗布過濾,合并二次濾液進行抽濾。抽濾液用旋轉蒸發儀進行濃縮,濃縮到一定程度(約2%濾液),傾出用水浴鍋繼續濃縮,濃縮到每ml含生藥量約3.2 g,加入揮發油合并為復方提取物,置于4 ℃冰箱待用。

1.3主要儀器及試劑 主要儀器:冷凍離心機(MIKRO 200R,Andreas Hettich GmbH &Co.KG)、Thermo Multiskan Go全波長酶標儀(美國Thermo Fisher公司);BSA124-CW電子天平〔賽多利斯(上海)貿易有限公司〕。主要試劑:生理鹽水水(山東華魯制藥有限公司,批號:016101215),小鼠干擾素(INF)-γ酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(批號:H11017904),白細胞介素(IL)-4 ELISA檢測試劑盒(批號:L11017905)購自武漢華美生物科技有限公司。

1.4分組與給藥途徑 隨機分為5組,每組10只,模型組灌胃給予溶媒0.2 ml/10 g,陽性藥組腹腔注射環磷酰胺30 mg/kg。雞血藤復方提取物按照該組方的1、2、4倍于臨床等效劑量換算為小鼠劑量〔15〕:低、中、高劑量組灌胃給予6.25、12.50、25.00 ml原液/kg。

1.5荷瘤鼠制備 取復蘇的鼠源Lewis肺癌細胞5管,每管數量約為1×107,接種至C57小鼠腋下皮下,讓其自然生長,約14 d,長到直徑1 cm以上。

1.6腫瘤接種及給藥 選擇腫瘤生長旺盛且無潰破的荷瘤鼠,頸椎脫臼處死,在無菌條件下(超凈臺或接種罩),用新潔爾滅消毒皮膚,切開皮膚,剝離腫瘤。將瘤組織剪成1.5 mm3左右,用套管針接種于受試小鼠雙側腋窩皮下,次日按體質量隨機分組,同時開始給藥,各組均每日給藥1次,連續 14 d。

1.7測定指標 (1)各組小鼠于給藥前及給藥后7、14 d進行體質量稱量;(2)實驗結束后,各組小鼠摘眼球取血約0.6 ml,分離血清,冷藏備用,用于測定INF-γ、IL-4;又取血約0.4 ml抗凝,用流式細胞儀進行CD4+、CD8+檢測。(3)處死并解剖各組小鼠,分離出胸腺和脾臟,分別稱重,計算臟器指數,臟器指數=胸腺或脾臟(mg)/小鼠體質量(g)。(4)各組小鼠剝除完整的腫瘤塊并馬上稱重量,計算腫瘤抑制率,腫瘤抑制率=(空白組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/瘤重×100%。(5)動物病理檢測:每組小鼠剝取Lewis肺癌實體瘤后,標本在10%甲醛溶液中固定完全后取部分腫瘤組織,經脫水、包埋、切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,用普通光學顯微鏡觀察,結合參考文獻對組織病理病變分級進行判定〔16〕,組織病理病變分級標準:組織壞死0%～5% 1分,6%～15% 2分,16%～30% 3分,31%～60% 4分,61%～100% 5分。組織病理炎癥細胞浸潤程度分級標準:正常(無炎癥細胞浸潤)0分,最輕度(浸潤<1%)1分,輕度(浸潤1%～25%)2分,中度(浸潤26%～50%)3分,重度(浸潤51%～75%)4分,超重度(浸潤76%～100%)5分。

1.8統計學處理 采用GraphPad Prism6.0生物統計學軟件進行方差分析、Dunnett多重比較、Kruskal-Wallis秩和檢驗。

2 結 果

2.1雞血藤復方提取物對體質量的影響 如表1所示,與模型組比較,給藥7、14 d后,各給藥組體質量均有不同程度減輕,其中高劑量組、陽性藥組體質量減輕均有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。

表1 各組體質量和血清IFN-γ、IL-4及瘤重、腫瘤抑制率比較

2.2雞血藤復方提取物對血清中免疫細胞因子INF-γ、IL-4的影響 如表1所示,與模型組比較,低、中、高劑量組血清中INF-γ、IL-4含量均不同程度升高,但差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.3雞血藤復方提取物對小鼠瘤重、腫瘤抑制率的影響 如表1所示,與模型組比較,各給藥組小鼠瘤重均不同程度降低,其中高劑量組、陽性藥組瘤重降低差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。

2.4雞血藤復方提取物對胸腺指數、脾臟指數的影響 如表2所示,與模型組比較,陽性藥組脾臟指數有下降趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05),胸腺重量、胸腺指數、脾臟指數均顯著下降(P<0.05)。

表2 各組胸腺指數、脾臟指數、病理評分比較

2.5肉眼及鏡下觀察小鼠腫瘤病理學改變 肉眼可見:模型組腫瘤體積較大,形態不規則,質脆易破,切開后極少見腫瘤組織壞死;低劑量組腫瘤體積較模型組略小,形態不規則,切開后少見腫瘤組織壞死;中劑量組腫瘤體積較模型組減小,形態不規則,切開后可見腫瘤組織壞死;高劑量組腫瘤體積較模型組明顯減小,形態不規則,切開后可見較多腫瘤組織壞死;陽性藥組腫瘤體積較模型對照組明顯減小,切開后可見大量腫瘤組織壞死。見圖1。與模型組相比,高劑量組和陽性藥組的組織壞死程度明顯增多(P<0.05,P<0.01)。見表2。

圖1 肉眼觀測各組腫瘤形態

經顯微鏡下觀察得知:模型組腫瘤鏡下見細胞密集排列,細胞核肥大、畸形,染色深,核染色分布不均勻,病理性核分裂現象多見,異型性明顯。低劑量組腫瘤鏡下見細胞密集排列稍減低,細胞核肥大、畸形,染色深,核染色分布不均勻,病理性核分裂現象多見,異型性明顯;腫瘤組織間質中可見淋巴細胞浸潤。中劑量組腫瘤鏡下見細胞密集排列減低,染色質濃縮邊集,病理性核分裂現象較多,異型細胞較多;部分瘤組織破壞;腫瘤組織間質中可見淋巴細胞浸潤。高劑量組腫瘤鏡下見細胞密集排列減低,病理性核分裂現象降低,異型細胞降低;部分瘤組織破壞;腫瘤組織間質中可見淋巴細胞浸潤。陽性藥組腫瘤鏡下見細胞密集排列明顯減低,病理性核分裂現象降低,異型細胞降低;大量瘤組織破壞;腫瘤組織間質中可見大量炎細胞浸潤。見圖2。

圖2 各組腫瘤病理學改變(HE染色)

3 討 論

腫瘤的發生是細胞生長異常、分化失控的結果,目前認為是癌基因、腫瘤抑制基因、凋亡調節基因和DNA修復調節基因等多個基因聯合發生突變造成的。 近年來,臨床研究指出,惡性腫瘤發病可能和細胞因子具有密切關系,機體遭受損傷后免疫系統會誘導生成炎癥細胞,大量釋放炎性因子、趨化因子等,產生腫瘤微環境,加速腫瘤血管生成、增殖、細胞浸潤及轉移等〔17〕。中醫藥方劑往往有多種有效成分可針對腫瘤的多種發病機制發揮作用,調控多種信號通路,抑制多種炎癥因子的優勢〔18〕。中醫藥在現代腫瘤治療中起到增效減毒、預防復發轉移等補充治療作用〔19〕。雞血藤是一味養血活血中藥,中醫古籍記載用于治療月經不調、血虛萎黃、風濕痹痛等癥。雞血藤具有促進骨髓造血、改善血流動力學、降壓、雙向調節免疫功能、抗病毒作用。有研究報道,雞血藤對小鼠移植性H22肝癌、Lewis肺癌、S180肉瘤均有一定的抑制作用,并且雞血藤在抗腫瘤的同時,具有增加白蛋白水平、增強免疫、減輕骨髓抑制的作用。本實驗結果提示,雞血藤復方提取物可以抑制腫瘤生長。INF-γ是重要的免疫應答調節劑,由T輔助(Th)1細胞分泌,它能激發細胞介導的免疫反應來殺滅細胞內病原菌。可在體內增強自然殺傷(NK)細胞和T細胞的免疫反應〔20,21〕。激活單核巨噬細胞,增強抗原提呈,促進Th0細胞向Th1分化〔22〕。同時也可以通過調節細胞周期、抑制血管生成、增強腫瘤的免疫原性、調節腫瘤微環境等途徑抑制腫瘤發生〔23〕。IL-4由Th2細胞分泌,激發體液免疫,產生抗體,殺滅細胞外病原菌〔24〕。IL-4作用包括刺激B細胞、促使B細胞向漿細胞分化及誘導B細胞分泌免疫球蛋白(Ig)E,促使Th細胞向Th2型細胞分化,并抑制Th1型細胞產生。本實驗INF-γ和IL-4無統計學意義的原因可能是藥物劑量仍未到適宜濃度,后續可調整劑量進行測試。生物反應調節劑與傳統的化療藥物相比,細胞毒性更小,可增強機體免疫功能,對腫瘤細胞的特異性和選擇性更強。研究發現,通過免疫治療的方法成了肺癌新的治療方法,化療與免疫治療也有一定的協同增強效果,進一步增加抗腫瘤效果〔25～28〕。本實驗結果提示,環磷酰胺在發揮抗腫瘤作用時,會明顯對人體免疫系統造成傷害,導致免疫功能下降,患者體質較差,易發生并發癥,增加治療難度。本研究結果提示,雞血藤復方提取物不會對人體免疫系統造成損傷,甚至對免疫系統有所增強,該復方可能利于輔助抗腫瘤治療,提高抗腫瘤效果,減輕放化療對身體造成的毒性副作用。

綜上,雞血藤復方提取物具有抑制腫瘤生長的作用,其作用機制可能是作為生物反應調節劑,參與調節免疫功能、促進腫瘤細胞死亡、抑制腫瘤細胞增殖等相關。