蝎毒注射液對AD模型大鼠空間認知障礙改善作用及對海馬IGF-1/PI3K/Akt信號通路的影響

范紅波 黃欣媛

(1湖北職業技術學院醫學基礎部,湖北 孝感 432000;2湖北工程學院生命科學技術學院)

阿爾茨海默病(AD)是老年人常見的以漸進性記憶和認知衰退為特征的神經退行性疾病,其發病機制與大腦皮質和海馬中β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成老年斑密切相關〔1〕。AD病因復雜,中藥診治在AD治療中得到重視。蝎毒是傳統中醫藥材,有鎮痛、抗炎、抗腫瘤等藥理作用,治療神經系統疾病已有多年歷史。國內已有商品化的蝎毒蛋白藥物制品——蝎毒注射液(SVI),目前該藥在臨床上僅用于鎮痛。有研究表明,蝎毒蛋白中的耐熱組分——蝎毒耐熱蛋白(SVHRP)能夠改善AD模型大鼠學習記憶障礙〔2,3〕,研究也發現SVI能夠增加AD大鼠皮質及海馬腦源性神經營養因子(BDNF)的表達,改善學習記憶能力〔4〕。胰島素樣生長因子(IGF)-1和BDNF在神經保護和營養作用方面有密切聯系,IGF-1能促進BDNF分泌,提高BDNF活性,起到更好神經保護的作用〔5〕。IGF-1主要通過磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路向胞內傳遞信號,促進神經元及膠質細胞增生及分化,其異常表達與AD關系密切〔6〕。本研究考察SVI對AD模型大鼠海馬中IGF-1/PI3K/Akt信號通路的影響,研究SVI改善AD大鼠認知功能的分子機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 SVI購自通化衛京藥業股份有限公司(批號:20150802,蝎毒蛋白含量為10 μg/ml),Aβ25～35為Sigma公司產品,IGF-1、PI3K、Akt、p-Akt(Ser473)和β-肌動蛋白(actin)一抗均為Abcam公司產品,辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗購自武漢博士德生物工程有限公司,Trizol試劑和逆轉錄試劑盒為Invitrogen公司產品,二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑、增強化學發光(ECL)試劑及聚合酶鏈反應(PCR)引物均為上海生工生物公司產品。

1.2實驗動物分組 6～7周齡SPF級健康雄性SD大鼠,體質量(230±20)g,購于湖北省實驗動物中心。在溫度20～23 ℃、相對濕度(50±5)%環境下,自由飲食和飲水適應性飼養7 d,編號后按照隨機數字表分為5組:假手術對照組,AD模型組及SVI低、中、高劑量干預組,每組12只。

1.3AD模型制作與SVI干預 參照文獻〔7〕報道的方法制備AD模型大鼠,即采用腦立體定位儀在大鼠雙側海馬區定位(前囟后3.3 mm,旁開1.8 mm,顱骨表面下3.5 mm)注射5 μg/μl的Aβ25～35溶液2 μl,10 min內緩慢注射完,留針5 min。假手術對照組注射2 μl無菌生理鹽水。于AD造模完成后24 h開始腹腔注射SVI,每日1次,連續10 d。SVI低、中、高劑量組SVI注射量分別為5、10、20 μg/kg。選用SVI中劑量組為后續實驗SVI干預組。

1.4Morris水迷宮實驗檢測大鼠的認知能力 于SVI干預治療完畢次日開始對5組進行定位航行實驗,持續5 d。將水迷宮圓形水池分為4個象限,逃生平臺置于其中一個象限內。每只大鼠固定時間訓練2次/d,記錄其入水后120 s內找到水下逃生平臺所用的時間,即逃避潛伏期,檢測大鼠學習和記憶能力。第6天撤去逃生平臺,進行空間探索實驗,記錄各組入水后120 s內穿過原平臺區域的次數及在原平臺所在象限游泳的時間,檢測大鼠對平臺空間位置的記憶保持能力。

1.5免疫組織化學法測定海馬中IGF-1表達 水迷宮實驗結束后,對假手術對照組、AD模型組和SVI干預組進行海馬組織取材。每只大鼠腹部注射10%水合氯醛(4 ml/kg)進行麻醉,脫頸椎處死后立即取全腦,置于冰皿上剝離兩側海馬組織,其他組織置于-80 ℃冰箱保存。每組隨機選取3只進行免疫組化實驗。將海馬組織置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h,30%蔗糖溶液脫水,石蠟包埋,恒冷箱切片機連續切5 μm厚度的薄片。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,5 min/次,加入羊抗大鼠IGF-1一抗(1∶500),4 ℃濕盒中孵育過夜。PBS沖洗3次,加入HRP標記的二抗(1∶2 000),37 ℃濕盒中孵育1 h,PBS漂洗3次,二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑避光反應30 min,PBS沖洗,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察并拍片,IGF-1免疫陽性反應的細胞呈棕褐色。每只大鼠選取5張照片,每張取海馬CA1區中段3個視野,運用ImageJ 1.52v圖像分析軟件測定陽性細胞的平均光密度。

1.6RT-PCR法檢測海馬中IGF-1、PI3K和Akt的mRNA表達 按1.5方法獲取大鼠海馬組織,用Trizol試劑提取總RNA,超微量分光光度計測定RNA濃度和純度,利用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA,再以之為模板,實時定量PCR擴增反應檢測IGF-1、PI3K和Akt的mRNA表達量變化,內參為β-actin。基因特異性引物分別為:IGF-1上游引物:5′-GCACTCTGCTTGCTCACCTTTA-3′,下游:5′-TCCG-AATGCTGGAGCCATA-3′,擴增片段長148 bp。PI3K上游引物:5′-AGCTGGTCTTCGTTTCCTGA-3′,下游:5′-GAAACTTTTTCCCACCACGA-3′,擴增片段長165 bp。Akt上游引物:5′-TCCTGCACCTGGAGCT CTGTTA-3′,下游:5′-CTCAGGGCAGCAGGACATGTAG-3′,擴增片段長199 bp。β-actin上游引物:5′-GAGACCTACAAGACCCCAGCC-3′,下游:5′-TCGGCGCATCGGTACCGCTCA-3′,擴增片段長183 bp。PCR條件為95 ℃預變性5 min;95 ℃變性20 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,39個循環;72 ℃延伸8 min。用2-ΔΔCt法分析目的基因較內參基因β-actin相對表達水平。

1.7Western印跡法檢測海馬中PI3K、Akt、p-Akt(Ser473)蛋白表達 按1.5方法獲取各組海馬組織剪碎后加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液,冰浴中勻漿提取總蛋白,BCA法定量測定蛋白濃度,根據濃度確定上樣量,進行12%分離膠的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),條帶轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜,根據分子量大小剪膜后各加入相應的IGF-1(1∶2 000)、PI3K(1∶2 000)、Akt(1∶1 500)、p-Akt(1∶2 000)、β-actin(1∶2 000)一抗,室溫下搖動孵育2 h,等滲緩沖鹽溶液(TBST)清洗,加入HRP標記二抗(1∶2 000),室溫搖動孵育2 h,TBST清洗,ECL試劑盒顯色,化學發光成像儀檢測記錄結果。ImageJ v1.52圖像軟件分析條帶的灰度。蛋白相對表達水平用目的蛋白條帶與內參β-actin條帶灰度的比值來表示。

1.8統計學分析 采用GraphPad Prism8軟件,各組數據之間的差異性采用單因素方差分析,組間均數比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1Morris水迷宮實驗結果 與假手術對照組比較,AD模型組逃避潛伏期延長,平臺穿越次數顯著減少(P<0.01)。SVI低、中、高劑量組,第1～5天逃避潛伏期均顯著少于AD模型組,平臺穿越次數和目標象限停留時間顯著多于AD模型組(P<0.01)。見表1。

表1 各組學習記憶能力比較

2.2免疫組織化學檢測IGF-1含量 AD模型組平均光密度值(22.52±4.89)明顯低于假手術對照組(45.46±5.92);SVI干預組(38.96±5.58)明顯高于AD模型組(均P<0.05),但與假手術對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 免疫組化分析各組海馬中IGF-1表達(DAB染色,×400)

2.3IGF-1、PI3K與Akt mRNA和蛋白表達 AD模型組和SVI干預組IGF-1和PI3K mRNA相對表達水平均顯著低于假手術對照組,SVI干預組IGF-1、PI3K和Akt mRNA相對表達水平明顯高于AD模型組(P<0.05);與假手術對照組相比,AD模型組和SVI干預組PI3K、Akt與p-Akt(Ser473)蛋白表達量均顯著下降(P<0.05)。與AD模型組比較,SVI干預組PI3K、p-Akt(Ser473)、p-Akt/Akt蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 各組海馬組織中PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達

表2 各組海馬組織內IGF-1、PI3K和Akt mRNA及蛋白表達水平比較

3 討 論

AD在65歲以上老年人中發病率高達1%～2%,85歲以上3.35%〔1〕,因而闡明AD發病機制對其預防和治療具有重要意義〔2〕。SVHRP還可通過抑制小膠質細胞介導的炎性反應或抑制神經元型一氧化氮合酶活性,或上調海馬組織BDNF表達水平,分別對帕金森癥、癲癇等疾病發揮改善作用〔2,3,8,9〕,但具體作用機制尚未十分明確。蝎毒對神經系統疾病展現出潛在的治療價值,需闡明其作用機制,為臨床應用提供理論依據。

本研究Morris水迷宮實驗與于勝波等〔2,10〕研究結果類似。該研究發現SVHRP可抑制Aβ引起的突觸密度降低和突觸退變,削弱Aβ對AD模型大鼠學習記憶能力的損害。Zhang等〔11〕也報道了SVHRP對表達人Aβ1～42的轉基因秀麗隱桿線蟲的毒性緩解和神經保護作用,提示蝎毒有成為治療AD藥物的潛力。

在中樞神經系統中,IGF-1是一種多肽類神經營養因子,廣泛表達于神經元及膠質細胞,具有神經保護作用。IGF-1及其下游信號通路是預防或治療認知功能減退的潛在靶點〔12〕。在大腦中,IGF-1與其受體結合后,主要通過激活PI3K/Akt信號途徑來參與調控神經細胞的生長代謝、突觸可塑性和神經組織修復,其異常表達與AD密切相關〔6,13,14〕。PI3K/Akt信號途徑被激活后,至少可通過以下途徑阻止AD的惡化:使下游的糖原合成酶激酶(GSK)-3β被磷酸化,活性降低,減少tau蛋白過度磷酸化〔12〕;同時激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外調節蛋白激酶(ERK)1/2信號通路,降低細胞中β-淀粉樣前體蛋白裂解酶(BACE)-1的表達,從而減少Aβ的生成和沉積〔15〕。AD患者和AD模型大鼠大腦中IGF-1水平降低,提升內、外源IGF-1水平能改善AD模型鼠的認知功能,IGF-1已成為治療AD的神經保護劑〔12,14,16〕。本研究結果說明,IGF-1/PI3K/Akt信號通路被抑制,與有關研究結果一致〔17〕。而給予AD大鼠SVI治療后,說明SVI能活化IGF-1/PI3K/Akt信號通路,有助于AD治療。