基于JAK-STAT信號通路探討首烏益智膠囊對血管性認知障礙神經保護機制

寧家輝 王蕾 衣紅杰 韓雪 孫旭

(山東中醫藥大學 1中醫學院,山東 濟南 250014;2第二附屬醫院神經內科)

血管性認知障礙(VCI)是一類嚴重危害人類健康的重大疾病〔1〕。VCI的病理機制十分復雜,主要包括缺血、缺氧誘導的細胞應激事件、炎性反應及繼發的神經元損傷和凋亡〔2〕。若長時間不能恢復細胞內環境穩態,終將導致神經元大量丟失,加重認知障礙進展與惡化。

p-Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)-信號轉導與轉錄激活因子(STAT)信號通路是近年來新發現的一條細胞內信號轉導途徑,與細胞增殖、分化、凋亡等過程密切相關〔3〕。其主要作用于基因表達的調控,是多種細胞因子的下游調控途徑〔4〕。JAK-STAT通路蛋白廣泛存在于海馬及大腦皮層,參與海馬缺血損傷修復、神經細胞增殖等多種細胞活動〔5〕。同時,JAK-STAT通路的激活是多種神經營養因子發揮神經保護作用的基礎。研究顯示,JAK-STAT通路可促進突觸可塑性,在海馬神經突觸的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)依賴突觸長時程增強機制中發揮促進作用〔6〕。有研究顯示首烏益智膠囊具有促神經細胞增殖、抑制神經細胞凋亡等多種神經保護作用〔7,8〕,可改善VCI患者學習、記憶能力,臨床功效顯著。本實驗采用大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)法建立VCI大鼠模型,探討首烏益智膠囊對VCI大鼠的治療效果及其神經保護機制,為完善首烏益智膠囊的作用機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級SD大鼠50只,體質量(350±20)g,雌雄各半。大鼠均飼養在(25±1)℃無菌環境中,12 h光照/12 h黑暗周期,自由進食和飲水。

1.2分組及給藥 取40只大鼠隨機分為假手術組、VCI模型組、首烏益智膠囊組及尼莫地平組,每組10只。采用MCAO法對除假手術組外的大鼠進行造模,將首烏益智膠囊(山東中醫藥研究院,批號:魯藥制字 Z20110015)制成40 mg/ml的懸濁液,給首烏益智膠囊組進行灌胃(1 ml/100 g),1次/d。將尼莫地平片(尼膜同,拜耳醫藥保健有限公司,批號:國藥準字 H20003010)制成30 mg/ml懸濁液,給尼莫地平組進行灌胃(1 ml/100 g),1次/d。模型組及假手術組給予等量生理鹽水灌胃,共14 d。14 d后,各組進行水迷宮實驗,21 d處死大鼠,進行組織學觀察。

1.3VCI大鼠模型的制作 MCAO法建立VCI大鼠模型。5%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉后,固定大鼠頸前正中切口,分離暴露左側頸總動脈、頸內外動脈。將尼龍縫合線于頸總動脈至頸內動脈分叉處導入,沿頸內動脈向大鼠顱內推進,穿過大腦中動脈起始端,直至大腦前動脈近端。結扎頸內動脈,縫合切口,留取1 cm拴線尾端。缺血90 min后外拉拴線至頸內動脈,縫合切口。假手術組在不結扎、栓塞的情況下進行相同手術。

1.4Morris水迷宮測試 于暗室中央放置圓形水池,距水面2 cm,不可見處固定平臺,實驗前對大鼠進行4 d適應性訓練。正式測試時,將大鼠于距原平臺最遠處放下,120 s內記錄大鼠找到平臺時間(逃逸潛伏時間)。24 h后,撤去平臺,于相同位置放下大鼠,120 s內記錄大鼠過平臺次數。

1.5透射電鏡觀察 干預14 d,每組隨機取5只大鼠,5%水合氯醛間斷腹腔注射法麻醉,4%多聚甲醛灌注,迅速斷頭剝離腦組織,在冰盒上沿冠狀位分離出海馬組織(1 mm3)數塊,進行固定、蔗糖溶液脫水、20 μm超薄切片,每只大鼠取5張玻片醋酸鈾-硝酸鉛雙重染色,日立-H765透射電鏡觀察大鼠腦組織海馬神經元超微結構。

1.6Western印跡檢測p-JAK2、p-STAT3及JAK2、STAT3 蛋白表達 每組取剩余5只大鼠,5%水合氯醛間斷腹腔注射法麻醉,分離海馬組織后置于液氮中保存,檢測時,將冰凍組織轉入勻漿緩沖液,加入蛋白酶抑制劑,離心后取上清液,二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒測定總蛋白濃度,經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后,轉移至聚偏氟乙烯膜上,p-JAK2、p-STAT3及JAK2、STAT3一抗孵育一夜,洗滌3次,二抗孵育2 h,檢測蛋白表達。

1.7統計學方法 采用SPSS26.0軟件進行雙因素方差分析。

2 結 果

2.1各組Morris水迷宮測試 與假手術組比較,模型組、尼莫地平組及首烏益智膠囊組逃避潛伏期明顯延長,過站臺次數明顯減少(P<0.01)。與模型組比較,尼莫地平及首烏益智膠囊組逃避潛伏期明顯縮短,過站臺次數明顯增加(P<0.05,P<0.01)。與尼莫地平組比較,首烏益智膠囊組逃避潛伏期明顯縮短,過站臺次數明顯增加(P<0.01)。首烏益智膠囊可以保護MCAO大鼠免受缺血缺氧造成的認知損害,改善大鼠的認知能力。見表1。

表1 各組Morris 水迷宮測試及海馬組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達

2.2各組JAK-STAT信號通路相關蛋白表達比較 與假手術組比較,模型組、尼莫地平組及首烏益智膠囊組海馬JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,首烏益智膠囊組JAK2蛋白表達顯著升高,尼莫地平組及首烏益智膠囊組p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達顯著升高(P<0.05,P<0.01)。與尼莫地平組比較,首烏益智膠囊組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達顯著升高(P<0.05)。首烏益智膠囊可以通過JAK-STAT信號通路發揮神經保護作用。見表1。

2.3各組海馬神經元結構觀察 透射電鏡觀察發現,假手術組海馬神經元結構完整,胞質內線粒體、內質網等細胞器結構完整,細胞核結構清晰,染色質均勻分布。模型組海馬神經元結構不規整,細胞核表面較粗糙,核內結構紊亂不齊,染色質輕度凝聚,胞質內線粒體部分腫脹變性,尼氏體、內質網數量減少,胞質內可見部分空泡。尼莫地平組海馬神經元結構尚規整,細胞核表面部分粗糙,核內結構尚完整可見,少量線粒體腫脹,內質網結構尚清晰,有輕度擴張。首烏益智膠囊組海馬神經元細胞核結構清晰,核膜光滑,雙層核膜可辨,胞質中線粒體、內質網、微管等細胞器結構完整且清晰可見,尼氏小體清晰,首烏益智膠囊可保護VCI大鼠損傷的神經元,維持神經元結構的完整性。見圖1。

圖1 各組海馬神經元超微結構(×4 000)

3 討 論

當下,VCI病理機制尚不明確,基于不同發病機制,各類造模方法層出不窮。MCAO是目前常用的VCI模型之一,通過模擬海馬等關鍵部位梗死使大鼠出現認知障礙。相較其他造模方案,MCAO可更好地模擬神經元變性與凋亡、炎性反應、氧化應激等嚴重腦組織損傷〔9,10〕。首烏益智膠囊由制首烏、益智仁、黃芪、天麻、丹參、地龍、遠志、川芎等組成,采用補腎填精益氣、祛瘀化痰通竅之法,使腎精得充,瘀血得祛,血脈通暢〔7〕。本研究結果表明,首烏益智膠囊可顯著改善MCAO大鼠的記憶、學習能力。研究發現,大鼠海馬組織與空間記憶、學習能力息息相關,而缺血再灌注損傷造成的海馬神經元凋亡是認知能力損傷的主要因素〔11〕。本研究結果表明,首烏益智膠囊可保護受損傷的神經元,維持神經元結構完整,抑制神經細胞的壞死與凋亡。

首烏益智膠囊的神經保護作用涉及多種活性成分及反應機制。二苯乙烯苷是何首烏的特異性活性物質,在各類腦器質性病變中起到神經保護作用,可挽救突觸并抑制大腦中α-突觸核蛋白過表達,從而改善其記憶和運動功能〔9〕。圓柚酮為益智仁主要活性成分,可作用于α-2a 腎上腺素能受體,進而生成腦源性神經營養因子,發揮抗神經細胞凋亡,促進神經再生的效用〔12〕。黃芪、天麻富含多種甾體類、多糖類成分,其與促進神經細胞增殖、抑制炎性反應等具有廣泛聯系,可促進表皮細胞生長因子(EGF)、血管內皮細胞生長因子受體(VEGFR)2等內皮生長因子表達,促進細胞增殖與代謝,同時使衰老、受損細胞存活〔13〕。丹參、地龍、川芎可有效提高腦血流量,并刺激一氧化氮合酶(NOS)3的生成,促進血管擴張及抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成,從而發揮血管保護及促血液流通作用〔14〕。本研究通過JAK-STAT信號通路證實,首烏益智膠囊對MCAO大鼠具有神經保護作用。

JAK-STAT信號通路是近年研究細胞存活、增殖、分化的重點通路,先前眾多研究顯示中樞神經系統損傷的修復與JAK-STAT通路的激活有關。JAK2 是JAKs家族中的重要組成部分之一,JAK2蛋白廣泛存在于大鼠神經元與少數膠質細胞內,其激活與炎性因子〔腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6等〕和生長因子〔EGF、血小板衍生生長因子(PDGF)等〕密切相關。最初,JAK2通過細胞膜受體結合作用磷酸化。隨后,p-JAK2激活細胞質中STAT3,從而導致STAT3的二聚化,p-STAT3易位至細胞核,與特定元素結合,然后轉錄各種靶基因發揮作用〔15〕。研究顯示,STAT3可促進神經干細胞的增殖與分化,抑制炎性反應,同時抑制神經細胞凋亡。研究發現,JAK-STAT信號通路可影響惡性NK細胞的細胞周期停滯與凋亡〔16〕,保護新生神經元。本研究結果證明,首烏益智膠囊通過激活JAK-STAT信號通路發揮促神經元增殖、維持神經元結構完整、抑制神經元凋亡等神經保護作用。

綜上,首烏益智膠囊可顯著改善腦缺血再灌注損傷后海馬神經元凋亡引起的認知障礙,同時激活JAK-STAT信號通路,促進神經元增殖,抑制神經元凋亡,減輕炎性反應,從而發揮神經保護作用。