核桃不同部位單寧含量測定方法研究

林 淼 楊海鋒 時(shí)文興 劉海燕

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 201403）

核桃（Juglans regiaL）又稱胡桃、羌桃、萬歲子等，在我國具有悠久的栽培歷史。我國核桃資源豐富[1]，主要分布在云南、山西、四川、河北等省。核桃不同部位有很高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。青皮是核桃和胡桃楸的未成熟外果皮，為民間常用中藥，含多種活性成分[2]；核桃分心木是指核桃內(nèi)的木質(zhì)隔膜，具有強(qiáng)腎固精和補(bǔ)益氣血等功效[3]；核桃種仁外有一層種皮，呈黃色或淺黃色，具有防止種仁氧化酸敗，保持采后品質(zhì)的功效[4]。然而在生活中，除果肉外，核桃其他部位大多被當(dāng)作廢棄物處理，造成了資源的浪費(fèi)，如能將其作為副產(chǎn)品資源化利用，不僅可以減少廢棄物產(chǎn)生、保護(hù)環(huán)境，也能帶來經(jīng)濟(jì)效益。植物單寧，是一種高度聚合的多酚化合物，具有抗氧化功能和抑菌作用，同時(shí)對(duì)慢性病有預(yù)防作用[5]。探討核桃中單寧的提取與測定方法，對(duì)促進(jìn)核桃單寧成分利用具有重要意義[6]。目前常見的檢測方法有EDTA 滴定法、磷鉬酸-鎢酸鈉比色法、毛細(xì)管氣相色譜和六氰合鐵（III）酸亞鐵鉀分光光度法等[1，7-11]。上述方法或使用的試劑對(duì)身體和環(huán)境有害，或需要用到大型精密儀器，操作復(fù)雜，價(jià)格較高。本試驗(yàn)應(yīng)用二甲基甲酰胺比色法快速檢測核桃中單寧含量，該方法簡便快捷，靈敏度高，結(jié)果較準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原理

利用二甲基甲酰胺提取核桃不同部位的單寧，提取、離心后加入顯色劑顯色，同時(shí)做空白對(duì)照，再用分光光度計(jì)于525 nm 測定待測液的吸光度值，以單寧酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線測定核桃不同部位的單寧含量。

1.2 儀器與試劑

儀器主要有分光光度計(jì)（8453 型，安捷倫公司）、高速離心機(jī)（ST16R型，Therom公司）、電子天平（AL204-IC型，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司）、渦旋混合器（美國Talboys公司）、粉碎機(jī)（DFT型，上海鼎廣機(jī)械設(shè)備有限公司）。單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)1401-55-4，純度≥98%）；75%二甲基甲酰胺溶液，取75 mL二甲基甲酰胺溶液，加20 mL水稀釋，待冷卻后定容至100 mL；3.5 g/L 檸檬酸鐵銨溶液，稱取0.35 g 檸檬酸鐵銨，用水溶解并定容至100 mL；氨水溶液，移取3.2 mL氨水，定容至100 mL。核桃樣品采集自云南臨滄市，分別剝?nèi)『颂仪嗥ぁ⒑颂曳N仁、內(nèi)種皮、分心木待測。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣品前處理取適量代表性試樣，用樣品粉碎機(jī)粉碎，將樣品裝于密封容器中，制成待測樣，0～20 ℃保存?zhèn)溆谩７Q取核桃各部位試樣1 g（精確至1 mg）至50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入20.0 mL 75%二甲基甲酰胺溶液，2 500 r/min 渦旋提取15 min，提取完畢后轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min。取上清液備用。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制準(zhǔn)確稱取單寧酸200 mg標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.1 mg），用水定容至100 mL。該標(biāo)準(zhǔn)溶液中單寧酸的質(zhì)量濃度為2 mg/mL，4 ℃冰箱密封保存，有效期7 d。分別移取該溶液0、1.0、2.0，3.0、4.0 和5.0 mL，并用檸檬酸鐵銨溶液定容至20 mL，配制的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL。

1.3.3試樣溶液測定依據(jù)單寧含量的高低，移取上清液1.0 mL。每個(gè)試樣取2 份：1 份準(zhǔn)確加入7.0 mL 水、1.0 mL 3.5 g/L 檸檬酸鐵銨溶液，用渦旋儀渦旋幾秒后加入1.0 mL 氨水溶液（取3.2 mL 氨水，定容到100 mL，下同），再渦旋幾秒。另外一份待測液做樣品空白，直接加入8.0 mL水和1.0 mL氨水溶液，渦旋幾秒鐘，用作試樣空白測定。若樣品試液測定濃度超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，則需將樣品待測液稀釋合適的倍數(shù)后重新測定。試樣的吸光度值測定結(jié)果為試液測定吸光值與試液空白測定吸光值兩值之差。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別移取單寧酸標(biāo)準(zhǔn)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL，準(zhǔn)確加入7.0 mL水、1.0 mL 3.5 g/L檸檬酸鐵銨溶液，用渦旋儀渦旋幾秒后加入1.0 mL氨水溶液，再渦旋幾秒。靜置（10±1）min，用分光光度計(jì)于525 nm測定吸光度值。以水作為空白對(duì)照。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中各吸光度值作為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的單寧酸濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5樣品中單寧含量的計(jì)算樣品中單寧含量的計(jì)算公式如下。

式中：w為試樣中單寧的含量（%）；c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查的單寧酸的濃度（mg/mL）；V為試樣測定液定容體積；f為試樣溶液稀釋倍數(shù)；m為試樣的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

傳統(tǒng)的單寧提取一般采用震蕩、超聲提取等方法，本試驗(yàn)嘗試使用渦旋提取，取得較好的提取效果。

2.1.1樣品提取方式優(yōu)化本試驗(yàn)用震蕩提取、超聲提取和渦旋提取方式對(duì)核桃各部位的單寧進(jìn)行提取，并對(duì)3 種方式的提取效率進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，在提取時(shí)間均為20 min的情況下，渦旋提取效果良好，結(jié)果見表1。

表1 不同提取方式下樣品單寧含量單位：%

2.1.2樣品提取時(shí)間的考察渦旋提取時(shí)間對(duì)單寧的提取率有影響，因此選取5 個(gè)不同的提取時(shí)間對(duì)樣品單寧提取并測定。結(jié)果表明：在2 500 r/min的最大渦旋速度下，當(dāng)提取時(shí)間為10 min 時(shí)樣品單寧含量最大，為保證對(duì)樣品中的單寧提取完全，應(yīng)將提取時(shí)間定到15 min，結(jié)果見表2。

表2 不同提取時(shí)間下樣品單寧含量單位：%

2.2 線性范圍測定

將濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 mg/mL 的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分光光度測定，以目標(biāo)物濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.259 1X+0.182 5，相關(guān)系數(shù)為0.999 4，該曲線表明，在0～0.5 mg/mL 范圍內(nèi)，單寧酸具有良好的線性關(guān)系。

2.3 檢出限與定量限

對(duì)濃度0.000 1～0.100 mg/mL 的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定（扣除試劑空白）。在單寧酸濃度為0.005 mg/mL時(shí)，連續(xù)測定10 次，吸光度均達(dá)到0.01以上，稱樣量1.0 g，加入20 mL提取液，比色時(shí)移取體積為0.2 mL，該方法的檢出限為0.5 mg/g（0.05%），定量限為3倍檢出限1.5 mg/g（0.15%）。

2.4 加標(biāo)回收與精密度測定

采用疊加法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，測定回收率和方法的準(zhǔn)確性。選取已知含量的核桃樣品，分別添加樣品本底含量一半的單寧，每個(gè)添加濃度做6 個(gè)平行，放置2 h后按照本研究優(yōu)化的樣品前處理方式處理測定。由表3 可知，單寧在核桃不同部位中的平均添加回收率在95.6%～112.5%，相對(duì)偏差介于2.1%～8.9%之間。從測定結(jié)果可知，單寧的加標(biāo)回收結(jié)果較好，滿足分析要求。

表3 樣品中單寧加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果單位：%

2.5 核桃不同樣品中單寧含量的測定

對(duì)采自云南的4 份核桃樣品，剝離出不同的部分，包括青皮、分心木、內(nèi)種皮和核桃種仁（去掉內(nèi)種皮），并分別對(duì)其單寧含量進(jìn)行計(jì)算，分析結(jié)果如表4所示。

3 結(jié)論

在核桃主產(chǎn)區(qū)，核桃青皮、分心木、核桃內(nèi)種皮等往往作為核桃仁、核桃乳生產(chǎn)的下腳料廢棄處理或作為燃料使用，其藥用、商用價(jià)值并沒有得到很好的開發(fā)，同時(shí)在廢棄、燃燒過程中還污染了環(huán)境。核桃各部位及時(shí)利用不僅能減少環(huán)境污染，也能充分開發(fā)其中的單寧活性成分。本文建立了一種快速簡便、準(zhǔn)確度高的單寧含檢測方法，可應(yīng)用于核桃不同部位單寧含量的分析檢測，也有助于快速評(píng)價(jià)核桃品質(zhì)。