基于線粒體COI 基因的DNA 條形碼在光唇魚屬魚類系統分類中的應用

李 強 黃文煒 彭蘇漢 周江偉 詹華偉 張鈺瑩 藍昭軍李文俊 桂 林*

（1廣州大學生命科學學院，廣東廣州 510006；2韶關市水產研究所，廣東韶關 512006）

光唇魚屬（Acrossocheilus）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鲃亞科（Barbinae）。光唇魚屬魚類廣泛分布于中國南部（包含臺灣和海南島）、越南和老撾[1]。對光唇魚屬各種或亞種的分類鑒定，傳統方法主要依據口唇結構形態、體色和背鰭末根不分枝鰭條粗壯程度以及后緣有無鋸齒等差異進行劃分。Kottelat[2]基于成體體色將光唇魚屬的種或亞種劃分為有垂直條紋類群（Barred group）和無垂直條紋類群（Nonbarred group）。然而，光唇魚屬的這些性狀除了種間差異顯著外，種內差異可能同樣顯著。袁樂洋[1]通過分析窄條光唇魚（A. stenotaeniatus）和虹彩光唇魚（A. iridescens）的形態特征，認為窄條光唇魚其實是虹彩光唇魚的幼體；《貴州魚類志》所記錄的厚唇光唇魚（A. labiatus）應為吉首光唇魚（A. jishouensis）[3]。因此，在光唇魚屬魚類的系統分類上，單靠個體形態的差異判斷，部分物種難以準確劃分。

DNA 條形碼通過利用有足夠變異的標準化短基因片段對物種進行分子層面上的生物身份識別。越來越多的研究結果都表明DNA 條形碼技術能夠快速、簡便、可信的對魚類物種進行鑒定[4-7]。其中COI基因相較于其他基因片段，序列長度比較適合，變異足夠多，相對保守，所以在物種鑒定上比較合適。本研究通過COI基因通用引物，對所采集的北江光唇魚（A. beijiangensis）、側條光唇魚（A. parallens）、帶半刺光唇魚（A. cinctus）、光唇魚（A. fasciatus）、虹彩光唇魚（A.iridescens）和吉首光唇魚（A. jishouensis）共26 尾個體進行特異性PCR 擴增，所得序列與Genbank 中已發表的光唇魚屬魚類COI基因進行聯合分析，探討光唇魚屬魚類的系統發育關系，同時檢驗COI基因序列對光唇魚屬魚類鑒別的有效性，以期為光唇魚屬魚類的系統發育及物種鑒定提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及DNA提取

本研究所使用的試驗材料為光唇魚屬的6種魚類，共計26個個體，分別采自廣東省韶關市（北江光唇魚、側條光唇魚）、湖南省吉首市（吉首光唇魚）、浙江省寧波市（光唇魚）、廣西壯族自治區桂林市（帶半刺光唇魚）和廣西壯族自治區河池市（虹彩光唇魚）。DNA 提取采用上海生工生物公司的柱式試劑盒，提取方法參照試劑盒自帶方法進行操作。

PCR引物為Ward等[8]設計的通用引物，具體序列如下：Fish1F（TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC）；Fish1R（TAGA 純CTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA）。引物由上海生工生物公司合成。PCR 反應總體積25 μL，其中ddH2O 7.5 μL，2 X Tag PCR-Master Mix 12.5 μL，模板DNA 3 μL，上下游引物各1 μL。PCR反應條件設置為94 ℃預變性3 min，進入35 個循環（94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min）最后72 ℃延伸5 min。PCR 擴增產物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認目標條帶后送往上海生工生物公司完成測序工作。

1.2 序列處理及分析

測序結果首先在NCBI 在線數據庫中進行比對檢驗，以初步確定試驗所得序列是目標片段。序列分析采用MEGA 6.0、DNAstar 5.0、BioEdit 7.2.5 等軟件進行。用MEGA 6.0 軟件對所測序列和所下載序列進行對比，計算序列的堿基組成、各物種的種內和種間遺傳距離；采用鄰接法（NJ），以雙參數法（Kimura 2-parameter）為替代模型，Bootstrap analysis 1 000次重復，構建系統進化樹。

從Genbank 中下載其余已發表出來的光唇魚屬的COI基因序列，結合本研究所得的6 種光唇魚屬序列進行比對分析。物種相關信息見表1。

表1 本研究所有13種光唇魚屬魚類的COI基因信息

2 結果與分析

2.1 光唇魚屬魚類COI基因堿基組成

本研究所用的引物位于COI基因的5'端，6 種光唇魚屬26 個個體均可以獲得線粒體COI基因部分序列，長度約為650 bp。這表明所使用的通用引物適用于本研究的6 種光唇魚屬魚類，該引物在光唇魚屬中具有一定的通用性。

對26 尾個體的COI基因序列和10 條已發表的光唇魚屬魚類COI序列進行比對分析，最終保留648 bp 的共有片段，共216 個密碼子，包括472 個保守位點、176 個變異位點、143 個簡約信息位點和33 個單核苷酸多態性位點，不存在堿基插入和堿基缺失的情況。所有序列的平均堿基組成：28.1%（T）、28.2%（C）、25.7%（A）和18.1%（G）。

2.2 種間及種內的遺傳距離

使用MAGE 6.0 軟件基于雙參數法模型，計算13種光唇屬魚類的種內和種間遺傳距離（表2）。由表2可知，種內遺傳距離都小于0.020 0，最大的為光唇魚。各物種種間平均遺傳距離，除了北江光唇魚與窄條光唇魚種間平均遺傳距離（0.015 7）外，其余都分布在0.030 2～0.177 4的范圍內，其中半刺光唇魚與側條光唇魚種間遺傳距離最小，說明它們是親緣關系很相近的2個物種，薄頜光唇魚與其他魚的種間遺傳距離都比較大，都超過0.130 0，最大為0.177 4，所以薄頜光唇魚與其他光唇魚屬的魚類親緣關系都較遠。

表2 光唇魚屬魚類兩兩比對的種間平均遺傳距離

2.3 光唇魚屬魚類分子系統進化樹分析

采用NJ 法構建13 種光唇魚屬魚類的分子系統進化樹，結果如圖1 所示。由圖1 可知，本研究光唇魚屬的每個物種不同個體都聚在同一分支上，所有6個物種的個體都可形成種的單系。側條光唇魚與半刺光唇魚形成一支，再與吉首光唇魚聚為姐妹分支，且節點支持率都比較高（高于94%）；北江光唇魚與窄條光唇魚結為一支，節點支持率達到100%，再與臺灣光唇魚結為一個分支；帶半刺光唇魚與溫州光唇魚連為一支，再與光唇魚聚為姐妹分支。虹彩光唇魚、薄頜光唇魚各自獨立形成一個分支；寬口光唇魚與云南光唇魚聚成2 個姐妹分支，再形成一個獨立分支。

圖1 NJ法構建的光唇魚屬魚類分子系統樹

3 討論與結論

本研究通過對光唇魚屬魚類13 個物種的COI基因648 bp 共有片段進行分析，結果表明不同物種的COI基因序列之間具有顯著差異，即COI基因作為DNA條形碼序列具有一定物種代表性。

本研究中各物種種內遺傳距離均小于0.020 0；而種間遺傳距離，除了北江光唇魚與窄條光唇魚種間平均遺傳距離為0.015 7 外，其余都大于0.020 0；種間遺傳距離平均值（0.090 1）是種內遺傳距離平均值（0.004 9）的18 倍，這與Hebert 等[9]得到的種間與種內遺傳距離的結論一致。

從分子系統進化樹上看，側條光唇魚、吉首光唇魚、北江光唇魚、光唇魚、帶半刺光唇魚、虹彩光唇魚各自的所有個體均形成單系。側條光唇魚與半刺光唇魚同在一個分支上，節點支持率也比較高，且兩者的種間遺傳距離也比較小（0.030 2），說明這2 個物種互相的親緣關系與其他物種比更接近；兩者再與吉首光唇魚聚為一支，節點支持率也比較高。同樣，帶半刺光唇魚與溫州光唇魚聚為一支；北江光唇魚與窄條光唇魚在系統樹上也聚為一支，但兩者的種間遺傳距離只有0.015 7，因此這2 個物種是否劃分為2 個物種有待進一步分析。薄頜光唇魚在系統樹的位置遠離其他光唇魚屬物種獨立形成一個分支，與其他光唇魚屬魚類的種間遺傳距離都超過0.130 0，表明薄頜光唇魚與其他光唇魚屬的親緣關系較遠。

窄條光唇魚最開始由褚新洛等[10]鑒定，并定義為光唇魚屬一個新物種，模式產地為云南剝隘。袁樂洋[1]通過形態學分析，認為窄條光唇魚是虹彩光唇魚的幼體。本研究中，通過Genbank 中已發表窄條光唇魚的COI基因序列與其他光唇魚屬魚類的比較，結果表明窄條光唇魚與北江光唇魚結成一個分支，節點支持率為100%，且窄條光唇魚與北江光唇魚的種間遺傳距離（0.015 7）小于Hebert 等[9]得出的最小種間遺傳距離（0.020 0），窄條光唇魚可能與北江光唇魚是相同的物種。

吉首光唇魚是趙俊等[11]1997 年發表的一個新種，模式產地在湖南吉首，其主要分布于沅江上游及支流。本研究中，在分子系統樹上，吉首光唇魚和側條光唇魚與帶半刺光唇魚所結成的分支聚成姐妹分支，且吉首光唇魚與兩者的種間遺傳距離（0.050 9和0.052 6）都明顯大于0.020 0，表明吉首光唇魚應為一個有效種。

伍獻文[12]根據福建和廣西標本形態差異，將半刺光唇魚和帶半刺光唇魚定義為2 個亞種，即為A. hemispinus hemispinus和A. hemispinus cinctus。袁樂洋[1]通過比較兩者的形態特征，認為應將它們提升到種的水平，并將拉丁名分別改為A. hemispinus和A. cinctus。本研究的結果表明，半刺光唇魚與帶半刺光唇魚的種間遺傳距離（0.069 0）明顯大于0.020 0，在NJ 系統樹上，半刺光唇魚與側條光唇魚結成一個分支，與吉首光唇魚聚成姐妹群，而帶半刺光唇魚與溫州光唇魚結為一支，與光唇魚聚為姐妹分支，這與王莉等[13]得出的結論一致。因此，半刺光唇魚與帶半刺光唇魚應為2個獨立的物種。

綜上所述，線粒體COI基因適合于光唇魚屬魚類系統發育分析，且可以作為DNA條形碼對該屬魚類進行有效的分子鑒定。