艾司氯胺酮對大鼠骨折后骨生長相關因子的影響

盧蒙恩 崔蕎蕎 郭曉霞 馬智聰

骨折在臨床上是一種常見病、多發病。最新研究表明,我國每年發生創傷性骨折的人數超過400萬,且骨折發生率呈上升趨勢[1,2]。骨折愈合是一個極其復雜的生理過程,是多種細胞、細胞因子和細胞信號通路共同作用的結果[3]。艾司氯胺酮通過抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)發揮麻醉和鎮痛作用,廣泛應用于骨科手術和術后鎮痛[4]。研究表明,艾司氯胺酮能夠促進骨折愈合可能與增加骨折愈合中 BDNF、VEGF、BMP-2 的合成與釋放,但其研究存在一定的局限性,并未研究其他骨生長相關因子[5]。本實驗觀察對大鼠脛骨骨折模型腹腔注射艾司氯胺酮后血清中降鈣素相關基因肽(CGRP)、神經生長因子(NGF)、胰島素生長因子1(IGF-1)濃度的變化,探討艾司氯胺酮對大鼠骨折后骨生長相關因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 48只6周齡清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重(200±25)g,由山西醫科大學動物實驗中心提供。所有動物置于20℃左右動物房中分籠飼養1周,自由進食水及食物,以適應環境。隨機數字表法將動物分為2組,即:實驗組(腹腔注射艾司氯胺酮40 mg·kg-1·24 h-1,稀釋至1 ml),對照組(腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 ml)。離心機(Thermo Fisher,美國);LX-800酶標儀(Thermo Fisher,美國)。艾司氯胺酮(廠家:江蘇恒瑞醫藥股份有限公司,批號:210828BL);CGRP酶聯免疫吸附試驗盒(廠家:江蘇酶免,批號:MM-0490R1);NGF酶聯免疫吸附試驗盒(廠家:江蘇酶免,批號:MM-0187R1);IGF-1酶聯免疫吸附試驗盒(廠家:江蘇酶免,批號:MM-0197R1)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立:將48只SD大鼠隨機均分為實驗組和對照組,禁飲食12 h后使用7%水合氯醛麻醉,于骨折模型打擊器下方仰臥位固定大鼠四肢,將右側脛骨備皮后外展內旋固定于鐵砧上,將2.5 kg砝碼抬高至15 cm處自由下落致脛骨中段橫行骨折。在脛骨平臺處切皮、碘伏消毒,將0.8 mm克氏針插入髓腔,并行手法將骨折端復位后逆行插入骨折遠端固定,0.9%氯化鈉溶液沖洗后,關閉切口。為預防感染,造模后2組大鼠分籠飼養,5 d內肌內注射青霉素8 萬/100 g,隔日用碘伏消毒傷口。自造模后第1天起,實驗組每日腹腔內注射艾司氯胺酮40 mg/kg,稀釋至1 ml,對照組每日腹腔內注射0.9%氯化鈉溶液1 ml。

1.2.2 標本收集與處理:在造模后第1周、2周、4周分別從2組隨機選取8只禁飲食大鼠,腹腔給予7%水合氯醛麻醉后,于頸動脈置管取血,離心后置于-80℃冰箱保存待檢。取血后保留大鼠右側脛骨,4%多聚甲醛在4℃下固定24 h后使用20%乙二胺四乙酸脫鈣1個月,脫鈣完成后取骨痂組織,脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟,HE染色,在顯微鏡下觀察骨痂組織學特征。

1.2.3 Elisa法檢測2組大鼠血清中CGRP、NGF、IGF-1在各時間點的變化情況。

2 結果

2.1 實驗動物情況 實驗過程中48只SD大鼠未出現麻醉并發癥,術后切口未出現感染,均進入結果分析。

2.2 HE染色組織學比較 1周時對照組HE染色可見少量纖維細胞及軟骨細胞產生,實驗組HE染色可見大量纖維細胞及炎性細胞浸潤,新生血管增多;2周時對照組HE染色可見纖維細胞及少量軟骨組織和骨小梁存在,實驗組HE染色可見大量纖維細胞及軟骨組織存在,且骨小梁生成增多;4周時對照組HE染色可見纖維細胞及軟骨組織,骨小梁較成熟,實驗組HE染色可見大量纖維細胞及軟骨細胞,骨小梁成熟良好,且多為編織骨。見圖1。

圖1 2組建模后不同時間點骨組織形態(HE×100)

2.3 2組CGRP濃度比較 建模后對照組血清中CGRP濃度在2周時達到高峰,實驗組隨時間變化呈升高趨勢,不同時間點均比對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同時間點2組大鼠血清中CGRP濃度比較 n=24,pg/ml,

2.4 2組IGF-1濃度比較 建模后對照組血清中IGF-1濃度在2周時達到高峰,實驗組隨時間變化呈升高趨勢,不同時間點均高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同時間點2組大鼠血清中CGF-1濃度比較 n=24,ng/ml,

2.5 2組NGF濃度比較 建模后對照組血清中NGF濃度在2周時達到高峰,實驗組較對照組在1周時有明顯升高,但在2周及4周時實驗組血清中NGF濃度較對照組明顯下降(P<0.05)。見表3。

表3 不同時間點2組大鼠血清中NGF濃度比較 n=24,pg/ml,

3 討論

骨折愈合過程中,細胞因子在其中發揮著重要作用,它們能夠調節細胞增殖、分化和基質合成等過程,促進骨愈合,其中CGRP、IGF-1、NGF是骨生長相關因子。

艾司氯胺酮麻醉和鎮痛效果是R-氯胺酮的4倍,且不良反應的發生率較氯胺酮明顯降低,被廣泛應用于骨科、神經外科及婦產科等手術和術后發揮鎮痛、鎮靜作用[4]。研究表明,艾司氯胺酮能夠促進骨折愈合,這與其增加骨生長相關因子的合成和釋放有關[5]。本實驗發現, 建立大鼠脛骨骨折模型后,通過腹腔注射艾司氯胺酮,實驗組大鼠血清中CGRP、IGF-1水平在1、2、4周時明顯上調,而NGF水平只在1周時明顯升高,2、4周時表現為下降。

CGRP是一種廣泛存在于中樞和外周神經系統,具有促進成骨以及合成血管的神經肽[6]。已被證實,CGRP在骨折局部濃度明顯升高[7]。孫東良等[8]動物實驗表明,在腦外傷后合并骨折中,骨折端CGRP在骨折愈合的早中期表達增高,有利于多種細胞趨化、增殖與分化,促進成骨。有研究表明,骨折愈合過程由成骨細胞(osteoblast,OB)介導的骨形成和破骨細胞(osteoclast,OC)介導的骨吸收共同參與完成,而這一過程與核因子與核因子 κB 受體活化因子(receptor activator of nuclear factor κB,RANK)/核因子 κB 受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL)/骨保護蛋白(osteoprotegerin,OPG)信號通路緊密聯系[9]。有學者指出CGRP刺激OB分化,同時通過RANK/RANKL/OPG系統抑制OC的形成[10]。Kadriu等[11]發現氯胺酮在治療重度抑郁癥患者時能夠顯著增加OPG/RANKL比率和血漿中OPG水平,肖嘯等[12]研究發現,CGRP在一定濃度范圍內可以增強OPGmRNA 的表達,同時抑制 RANKL mRNA 的表達,并且能夠明顯上調 OPG/RANKL 的比值。結合本實驗,實驗組血清中CGRP在各時間點均高于對照組(P<0.05),認為艾司氯胺酮促進骨折愈合的機制可能與血清中CGRP水平上調,增加OPG/RANKL比率有關。

IGF-1是一種促進生長的內分泌激素,對細胞增殖、骨骼的生長發育及骨量和骨密度的維持方面起著重要的調控作用[13]。有研究表明,IGF-1通過活化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白,刺激募捐間的間充質干細胞向成骨分化,從而維持適當的骨微結構和骨量[14]。有學者指出IGF-1在骨形成及骨重建方面也有著重要調節效應[15]。說明IGF-1在骨細胞的增殖分化中起著重要的調控作用。在骨的重建過程中,骨基質釋放轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和IGF-1協同促進骨吸收和骨形成,加速骨的重建[16]。Wang等[17]在處理大鼠尿路上皮細胞時發現,使用氯胺酮可以促進TGF-β1的表達。另有研究表明,氯胺酮能夠增加內側前額葉皮層(medial prefrontal cortex,mPFC)突觸體制備的突觸蛋白,進而誘導釋放IGF-1[18]。結合本實驗中2組大鼠IGF-1水平研究結果,我們認為艾司氯胺酮促進骨折愈合的機制可能與mPFC的突觸蛋白增加,進而誘導IGF-1表達增加有關。

NGF是一種促進中樞和外周神經元生長、發育、分化、成熟和可塑性的重要調節因子[19]。Li等[20]研究發現,骨折愈合過程中NGF在骨膜基質祖細胞和骨折相關的巨噬細胞中的表達明顯上調,并促進神經纖維的生長和發育。而骨折的愈合和形成與神經系統的發育和維持密切相關,說明NGF在一定程度上能夠促進骨折愈合。另有研究發現,NGF能夠促進血管內皮細胞生長以及新生血管的成熟[21-23]。進一步印證NGF促進骨折愈合的作用。有學者發現在骨折斷端局部注射治療NGF后,骨痂生成量明顯增多,骨痂剛度和抗折彎強度也顯著增加[24]。馬樂圓等[25]通過動物實驗證實,NGF在骨折伴顱腦損傷的大鼠模型中明顯增加并加速骨折愈合。根據劉建軍等[26]應用NGF治療骨折大鼠的研究,結果顯示NGF能夠明顯促進IGF-1的分泌,進而促進成骨。本實驗中,相較對照組,實驗組NGF水平在1周時明顯上升,HE染色組織學結果顯示術后1周時大量纖維細胞及炎性細胞浸潤,新生血管增多,提示艾司氯胺酮在短期內能夠促進骨折愈合,并上調NGF水平,但在2、4周時實驗組NGF水平較空白組顯著下降,這一結論與Ke等[27]研究發現氯胺酮慢性濫用者的血清中NGF水平明顯低于健康人相符。根據 Rapp等[28]阻斷小鼠NGF/ 酪氨酸激酶受體 (tyrosine kinase receptor A,TrkA)信號轉導通路發現并不會影響骨折愈合的研究結果,提示長期應用艾司氯胺酮會導致NGF水平降低,但對骨折愈合無影響。另外給予NGF抗體或TrkA免疫球蛋白(TrkA-IgG)可消除或抑制NGF的增加[29],而萬麗等[30]觀察NMDA受體非特異性拮抗劑氯胺酮對甲醛致炎小鼠疼痛行為學的影響發現,至炎小鼠在注射40 mg/kg氯胺酮后背根節酪氨酸激酶受TrkA表達會受到抑制,我們認為艾司氯胺酮長期應用導致NGF水平下調可能與NGF特異性受體TrkA受到抑制有關。

綜上所述,CGRP、IGF-1、NGF的是艾司氯胺酮促進骨折愈合的相關因子,這些因子的作用可能是由于艾司氯胺作用于中樞神經系統,影響機體相關因子的產生和釋放而發揮作用,為臨床治療提供了新的思路和方法。