艾司氯胺酮對大鼠骨折后骨生長相關(guān)因子的影響

盧蒙恩 崔蕎蕎 郭曉霞 馬智聰

骨折在臨床上是一種常見病、多發(fā)病。最新研究表明,我國每年發(fā)生創(chuàng)傷性骨折的人數(shù)超過400萬,且骨折發(fā)生率呈上升趨勢[1,2]。骨折愈合是一個極其復(fù)雜的生理過程,是多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和細(xì)胞信號通路共同作用的結(jié)果[3]。艾司氯胺酮通過抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)發(fā)揮麻醉和鎮(zhèn)痛作用,廣泛應(yīng)用于骨科手術(shù)和術(shù)后鎮(zhèn)痛[4]。研究表明,艾司氯胺酮能夠促進(jìn)骨折愈合可能與增加骨折愈合中 BDNF、VEGF、BMP-2 的合成與釋放,但其研究存在一定的局限性,并未研究其他骨生長相關(guān)因子[5]。本實驗觀察對大鼠脛骨骨折模型腹腔注射艾司氯胺酮后血清中降鈣素相關(guān)基因肽(CGRP)、神經(jīng)生長因子(NGF)、胰島素生長因子1(IGF-1)濃度的變化,探討艾司氯胺酮對大鼠骨折后骨生長相關(guān)因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 48只6周齡清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重(200±25)g,由山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。所有動物置于20℃左右動物房中分籠飼養(yǎng)1周,自由進(jìn)食水及食物,以適應(yīng)環(huán)境。隨機(jī)數(shù)字表法將動物分為2組,即:實驗組(腹腔注射艾司氯胺酮40 mg·kg-1·24 h-1,稀釋至1 ml),對照組(腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 ml)。離心機(jī)(Thermo Fisher,美國);LX-800酶標(biāo)儀(Thermo Fisher,美國)。艾司氯胺酮(廠家:江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號:210828BL);CGRP酶聯(lián)免疫吸附試驗盒(廠家:江蘇酶免,批號:MM-0490R1);NGF酶聯(lián)免疫吸附試驗盒(廠家:江蘇酶免,批號:MM-0187R1);IGF-1酶聯(lián)免疫吸附試驗盒(廠家:江蘇酶免,批號:MM-0197R1)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立:將48只SD大鼠隨機(jī)均分為實驗組和對照組,禁飲食12 h后使用7%水合氯醛麻醉,于骨折模型打擊器下方仰臥位固定大鼠四肢,將右側(cè)脛骨備皮后外展內(nèi)旋固定于鐵砧上,將2.5 kg砝碼抬高至15 cm處自由下落致脛骨中段橫行骨折。在脛骨平臺處切皮、碘伏消毒,將0.8 mm克氏針插入髓腔,并行手法將骨折端復(fù)位后逆行插入骨折遠(yuǎn)端固定,0.9%氯化鈉溶液沖洗后,關(guān)閉切口。為預(yù)防感染,造模后2組大鼠分籠飼養(yǎng),5 d內(nèi)肌內(nèi)注射青霉素8 萬/100 g,隔日用碘伏消毒傷口。自造模后第1天起,實驗組每日腹腔內(nèi)注射艾司氯胺酮40 mg/kg,稀釋至1 ml,對照組每日腹腔內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液1 ml。

1.2.2 標(biāo)本收集與處理:在造模后第1周、2周、4周分別從2組隨機(jī)選取8只禁飲食大鼠,腹腔給予7%水合氯醛麻醉后,于頸動脈置管取血,離心后置于-80℃冰箱保存待檢。取血后保留大鼠右側(cè)脛骨,4%多聚甲醛在4℃下固定24 h后使用20%乙二胺四乙酸脫鈣1個月,脫鈣完成后取骨痂組織,脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟,HE染色,在顯微鏡下觀察骨痂組織學(xué)特征。

1.2.3 Elisa法檢測2組大鼠血清中CGRP、NGF、IGF-1在各時間點的變化情況。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物情況 實驗過程中48只SD大鼠未出現(xiàn)麻醉并發(fā)癥,術(shù)后切口未出現(xiàn)感染,均進(jìn)入結(jié)果分析。

2.2 HE染色組織學(xué)比較 1周時對照組HE染色可見少量纖維細(xì)胞及軟骨細(xì)胞產(chǎn)生,實驗組HE染色可見大量纖維細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤,新生血管增多;2周時對照組HE染色可見纖維細(xì)胞及少量軟骨組織和骨小梁存在,實驗組HE染色可見大量纖維細(xì)胞及軟骨組織存在,且骨小梁生成增多;4周時對照組HE染色可見纖維細(xì)胞及軟骨組織,骨小梁較成熟,實驗組HE染色可見大量纖維細(xì)胞及軟骨細(xì)胞,骨小梁成熟良好,且多為編織骨。見圖1。

圖1 2組建模后不同時間點骨組織形態(tài)(HE×100)

2.3 2組CGRP濃度比較 建模后對照組血清中CGRP濃度在2周時達(dá)到高峰,實驗組隨時間變化呈升高趨勢,不同時間點均比對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同時間點2組大鼠血清中CGRP濃度比較 n=24,pg/ml,

2.4 2組IGF-1濃度比較 建模后對照組血清中IGF-1濃度在2周時達(dá)到高峰,實驗組隨時間變化呈升高趨勢,不同時間點均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同時間點2組大鼠血清中CGF-1濃度比較 n=24,ng/ml,

2.5 2組NGF濃度比較 建模后對照組血清中NGF濃度在2周時達(dá)到高峰,實驗組較對照組在1周時有明顯升高,但在2周及4周時實驗組血清中NGF濃度較對照組明顯下降(P<0.05)。見表3。

表3 不同時間點2組大鼠血清中NGF濃度比較 n=24,pg/ml,

3 討論

骨折愈合過程中,細(xì)胞因子在其中發(fā)揮著重要作用,它們能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和基質(zhì)合成等過程,促進(jìn)骨愈合,其中CGRP、IGF-1、NGF是骨生長相關(guān)因子。

艾司氯胺酮麻醉和鎮(zhèn)痛效果是R-氯胺酮的4倍,且不良反應(yīng)的發(fā)生率較氯胺酮明顯降低,被廣泛應(yīng)用于骨科、神經(jīng)外科及婦產(chǎn)科等手術(shù)和術(shù)后發(fā)揮鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用[4]。研究表明,艾司氯胺酮能夠促進(jìn)骨折愈合,這與其增加骨生長相關(guān)因子的合成和釋放有關(guān)[5]。本實驗發(fā)現(xiàn), 建立大鼠脛骨骨折模型后,通過腹腔注射艾司氯胺酮,實驗組大鼠血清中CGRP、IGF-1水平在1、2、4周時明顯上調(diào),而NGF水平只在1周時明顯升高,2、4周時表現(xiàn)為下降。

CGRP是一種廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng),具有促進(jìn)成骨以及合成血管的神經(jīng)肽[6]。已被證實,CGRP在骨折局部濃度明顯升高[7]。孫東良等[8]動物實驗表明,在腦外傷后合并骨折中,骨折端CGRP在骨折愈合的早中期表達(dá)增高,有利于多種細(xì)胞趨化、增殖與分化,促進(jìn)成骨。有研究表明,骨折愈合過程由成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)介導(dǎo)的骨吸收共同參與完成,而這一過程與核因子與核因子 κB 受體活化因子(receptor activator of nuclear factor κB,RANK)/核因子 κB 受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL)/骨保護(hù)蛋白(osteoprotegerin,OPG)信號通路緊密聯(lián)系[9]。有學(xué)者指出CGRP刺激OB分化,同時通過RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)抑制OC的形成[10]。Kadriu等[11]發(fā)現(xiàn)氯胺酮在治療重度抑郁癥患者時能夠顯著增加OPG/RANKL比率和血漿中OPG水平,肖嘯等[12]研究發(fā)現(xiàn),CGRP在一定濃度范圍內(nèi)可以增強(qiáng)OPGmRNA 的表達(dá),同時抑制 RANKL mRNA 的表達(dá),并且能夠明顯上調(diào) OPG/RANKL 的比值。結(jié)合本實驗,實驗組血清中CGRP在各時間點均高于對照組(P<0.05),認(rèn)為艾司氯胺酮促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制可能與血清中CGRP水平上調(diào),增加OPG/RANKL比率有關(guān)。

IGF-1是一種促進(jìn)生長的內(nèi)分泌激素,對細(xì)胞增殖、骨骼的生長發(fā)育及骨量和骨密度的維持方面起著重要的調(diào)控作用[13]。有研究表明,IGF-1通過活化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白,刺激募捐間的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化,從而維持適當(dāng)?shù)墓俏⒔Y(jié)構(gòu)和骨量[14]。有學(xué)者指出IGF-1在骨形成及骨重建方面也有著重要調(diào)節(jié)效應(yīng)[15]。說明IGF-1在骨細(xì)胞的增殖分化中起著重要的調(diào)控作用。在骨的重建過程中,骨基質(zhì)釋放轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和IGF-1協(xié)同促進(jìn)骨吸收和骨形成,加速骨的重建[16]。Wang等[17]在處理大鼠尿路上皮細(xì)胞時發(fā)現(xiàn),使用氯胺酮可以促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)。另有研究表明,氯胺酮能夠增加內(nèi)側(cè)前額葉皮層(medial prefrontal cortex,mPFC)突觸體制備的突觸蛋白,進(jìn)而誘導(dǎo)釋放IGF-1[18]。結(jié)合本實驗中2組大鼠IGF-1水平研究結(jié)果,我們認(rèn)為艾司氯胺酮促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制可能與mPFC的突觸蛋白增加,進(jìn)而誘導(dǎo)IGF-1表達(dá)增加有關(guān)。

NGF是一種促進(jìn)中樞和外周神經(jīng)元生長、發(fā)育、分化、成熟和可塑性的重要調(diào)節(jié)因子[19]。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn),骨折愈合過程中NGF在骨膜基質(zhì)祖細(xì)胞和骨折相關(guān)的巨噬細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào),并促進(jìn)神經(jīng)纖維的生長和發(fā)育。而骨折的愈合和形成與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持密切相關(guān),說明NGF在一定程度上能夠促進(jìn)骨折愈合。另有研究發(fā)現(xiàn),NGF能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長以及新生血管的成熟[21-23]。進(jìn)一步印證NGF促進(jìn)骨折愈合的作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在骨折斷端局部注射治療NGF后,骨痂生成量明顯增多,骨痂剛度和抗折彎強(qiáng)度也顯著增加[24]。馬樂圓等[25]通過動物實驗證實,NGF在骨折伴顱腦損傷的大鼠模型中明顯增加并加速骨折愈合。根據(jù)劉建軍等[26]應(yīng)用NGF治療骨折大鼠的研究,結(jié)果顯示NGF能夠明顯促進(jìn)IGF-1的分泌,進(jìn)而促進(jìn)成骨。本實驗中,相較對照組,實驗組NGF水平在1周時明顯上升,HE染色組織學(xué)結(jié)果顯示術(shù)后1周時大量纖維細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤,新生血管增多,提示艾司氯胺酮在短期內(nèi)能夠促進(jìn)骨折愈合,并上調(diào)NGF水平,但在2、4周時實驗組NGF水平較空白組顯著下降,這一結(jié)論與Ke等[27]研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮慢性濫用者的血清中NGF水平明顯低于健康人相符。根據(jù) Rapp等[28]阻斷小鼠NGF/ 酪氨酸激酶受體 (tyrosine kinase receptor A,TrkA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)并不會影響骨折愈合的研究結(jié)果,提示長期應(yīng)用艾司氯胺酮會導(dǎo)致NGF水平降低,但對骨折愈合無影響。另外給予NGF抗體或TrkA免疫球蛋白(TrkA-IgG)可消除或抑制NGF的增加[29],而萬麗等[30]觀察NMDA受體非特異性拮抗劑氯胺酮對甲醛致炎小鼠疼痛行為學(xué)的影響發(fā)現(xiàn),至炎小鼠在注射40 mg/kg氯胺酮后背根節(jié)酪氨酸激酶受TrkA表達(dá)會受到抑制,我們認(rèn)為艾司氯胺酮長期應(yīng)用導(dǎo)致NGF水平下調(diào)可能與NGF特異性受體TrkA受到抑制有關(guān)。

綜上所述,CGRP、IGF-1、NGF的是艾司氯胺酮促進(jìn)骨折愈合的相關(guān)因子,這些因子的作用可能是由于艾司氯胺作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),影響機(jī)體相關(guān)因子的產(chǎn)生和釋放而發(fā)揮作用,為臨床治療提供了新的思路和方法。