PM2.5對(duì)HUVEC毒性及對(duì)ROS、MDA、LDH水平影響

嵇志剛 李天來 徐藝 王甜

細(xì)顆粒物(PM2.5)指空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm顆粒物,是霧霾重要組成成分,可長(zhǎng)時(shí)間懸浮于空氣中,對(duì)環(huán)境質(zhì)量和人體健康等可造成嚴(yán)重危害,有研究顯示PM2.5暴露與人群疾病死亡率、發(fā)病率以及住院率增加密切相關(guān)[1,2],且PM2.5每升高10 μg/m3,呼吸和心腦血管入院風(fēng)險(xiǎn)分別增加0.640%、0.697%,WHO在2005年制定PM2.5的準(zhǔn)則值,其年均值為10 μg/m3,日均值為25 μg/m3,我國(guó)在2012年將PM2.5納入空氣檢測(cè)指標(biāo),規(guī)定日均值為75 μg/m3,年均值為35 μg/m3(GB3095-2012),并且建立相應(yīng)檢測(cè)點(diǎn)[3]。PM2.5具有粒徑小、表面積大的特點(diǎn),其表面吸附了大量有機(jī)化學(xué)物質(zhì)、重金屬和病原微生物等,同時(shí)因?yàn)樵诖髿庵袦魰r(shí)間長(zhǎng)、輸送距離遠(yuǎn),被人體吸入的機(jī)會(huì)多,并且可以隨呼吸至下呼吸道,其中0.1 μm的顆粒物可以通過氣血屏障進(jìn)入血液循環(huán),對(duì)人體健康可以產(chǎn)生嚴(yán)重危害,隨著我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程的發(fā)展,PM2.5為主要成分的空氣污染已經(jīng)成了影響人們健康主要原因,主要危害存在于呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等慢性疾病方面[4,5]。本文通過不同濃度的PM2.5染毒人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),觀察PM2.5毒性,報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)試劑:HUVEC來源西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院惠贈(zèng);實(shí)驗(yàn)試劑:Tefion濾膜(購自北京海成世潔過濾器材有限公司)、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)、胎牛血清(FBS,美國(guó)Hyclone公司)、胰蛋白酶(美國(guó)Genview公司)、雙抗(北京愛普華美生物科技有限公司)、DMSO(購自西安國(guó)安生物科技有限公司)、四甲基偶氮唑鹽(MTT,美國(guó)Amresco公司)、焦碳酸二乙酯(DEPC,德國(guó)Sigma公司)、微量丙二醛(MDA)測(cè)試試劑盒(南京建成生物工程研究所)、乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試試劑盒(南京建成生物工程研究所)、活性氧(ROS)測(cè)試試劑盒(南京建成生物工程研究所)、MMP檢測(cè)試劑盒(JC-1)(碧云天)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(南京建成生物工程研究所)。(2)實(shí)驗(yàn)設(shè)備:KB-120F型智能TSP-PM2.5中流量采樣器(青島金仕達(dá)電子科技有限公司)、HEPA CO2培養(yǎng)箱(美國(guó),Thermo Forma 公司)、透氣培養(yǎng)瓶(加拿大,LabServ公司)、96孔板(加拿大,LabServ公司)、24孔板(加拿大,LabServ公司)、6孔板(加拿大,LabServ公司)、細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海化科實(shí)驗(yàn)器材有限公司)、Infinite M200酶標(biāo)儀(瑞士,TECAN公司)、倒置顯微鏡(日本,OLYMPUS公司)、流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5樣品采集和處理:采樣前將Teflon濾膜干燥平衡24 h,然后稱量(ml),按照采樣規(guī)范在約離地面21 m處進(jìn)行采集,連續(xù)采集14 h,采樣時(shí)詳細(xì)記錄采樣日期、樣品編號(hào)、采樣體積、氣象條件等;采完樣后將濾膜取下繼續(xù)平衡24 h后稱重(m2),m2-m1即為采集重量,PM2.5樣品采集及洗脫具體參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.2 PM2.5染毒濃度設(shè)計(jì)與配制:實(shí)驗(yàn)前配制4 mg/ml的大氣細(xì)顆粒物懸液為母液,根據(jù)參考文獻(xiàn)及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,大氣細(xì)顆粒物染毒濃度設(shè)計(jì)為25、50、100、200、300、400 μg/ml濃度染毒,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)前將母液用1640完全培養(yǎng)液稀釋到上述濃度。

1.2.3 MTT法測(cè)定HUVEC細(xì)胞增值情況:應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性,取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)較好細(xì)胞,按照以5×104個(gè)/ml的密度,接種于96孔板進(jìn)行培養(yǎng),同時(shí)設(shè)置調(diào)零組、對(duì)照組、25、50、100、200、300、400 μg/ml染毒組,每組5個(gè)復(fù)孔;將染毒好細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)6、12、18、24、36 h;培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束,避光每孔加入配制好的濃度的5 mg/ml的 MTT 溶液20 μl,繼續(xù)孵育4～6 h,每孔加入200 μl DMSO,在波長(zhǎng)550 nm酶標(biāo)儀中,檢測(cè)每孔吸光度(OD值)。

1.2.4 MDA、LDH及ROS檢測(cè):將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)較好細(xì)胞,按1×104個(gè)/孔,接種于96孔板上,培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后染毒,設(shè)置調(diào)零組,對(duì)照組、25、50、100、200、300、400 μg/ml染毒組,每組5個(gè)復(fù)孔,染毒24 h吸取上清液,嚴(yán)格按照MDA、LDH、ROS試劑盒試劑盒操作步驟進(jìn)行。

1.2.5 細(xì)胞凋亡率檢測(cè):取處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以1×106個(gè)/ml密度,接種于6孔板,培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后染毒,設(shè)置調(diào)零組,對(duì)照組、25、50、100、200、300 μg/ml染毒組,每組3個(gè)復(fù)孔,染毒24 h,染毒結(jié)束把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至離心管內(nèi),0.25%胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞,1 000 g離心5 min,棄上清,收集細(xì)并計(jì)數(shù),加入5 μl Annexin V-FITC,混勻,再加入5 μl碘化丙啶,混勻,室溫避光孵育10min,隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5染毒對(duì)HUVEC存活率影響 染毒6、12、18、24、36 h隨著染毒劑量升高,細(xì)胞存活率均逐漸降低,同一染毒濃度隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞存活率同樣下降(P<0.05),且在染毒36 h,PM2.5濃度為400 μg/ml,細(xì)胞存活率僅為45.23%。見表1。

表1 PM2.5不同染毒劑量、不同染毒時(shí)間HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)存活率 %,

2.2 PM2.5染毒對(duì)HUVEC MDA、LDH及ROS水平影響 PM2.5染毒HUVEC 24 h后,MDA、LDH、ROS水平,均隨著染毒劑量增加而升高,且300、400 μg/ml達(dá)到最大值,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 PM2.5染毒對(duì)HUVEC MDA、LDH及ROS水平影響

2.3 PM2.5染毒對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡率的影響 經(jīng)過PM2.5染毒后細(xì)胞早期凋亡率、中晚期凋亡率以及死亡細(xì)胞率均隨著染毒濃度升高具有上升趨勢(shì),其中早期凋亡率變化最為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(早期凋亡率隨著濃度均迅速上升,中晚期凋亡率和死亡率變化緩慢)。見表3,圖1。

圖1 不同PM2.5濃度染毒細(xì)胞24 h后流失細(xì)胞圖

表3 不同PM2.5濃度染毒細(xì)胞24h后細(xì)胞凋亡率變化

3 討論

PM2.5污染是造成環(huán)境污染重要因素之一,有研究顯示,>65歲的人群發(fā)現(xiàn)PM2.5每增加1.71 μg/m3,呼吸疾病以及心血管疾病的住院率分別增加3.47%、2.11%等[7],目前認(rèn)為PM2.5致病機(jī)制主要為自由基過氧化機(jī)制、轉(zhuǎn)錄因子和炎性質(zhì)因子激活等[8,9],認(rèn)為PM2.5進(jìn)入機(jī)體后可以誘發(fā)自由基可直接對(duì)DNA產(chǎn)生氧化損害,并且可以刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的炎性因子等。

本文通過MTT實(shí)驗(yàn)顯示在PM2.5染毒6、12、18、24、36 h隨著染毒劑量升高,細(xì)胞存活率均逐漸降低,同一染毒濃度隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞存活率同樣下降(P<0.05),且在染毒36 h,PM2.5濃度為400 μg/ml,細(xì)胞存活率僅為45.23%,這個(gè)不能滿足實(shí)驗(yàn)要求,說明PM2.5對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用,并呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系,這一結(jié)果可解釋為PM2.5染毒導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)、DNA損傷等,從而降低細(xì)胞的增殖能力,說明PM2.5對(duì)HUVEC細(xì)胞具有明顯的毒性效應(yīng)。

ROS在氧化應(yīng)激、動(dòng)脈粥樣硬化疾病中起著重要的作用[10]。不同濃度PM2.5染毒HUVEC 24 h后ROS水平隨著染毒劑量增加而升高,說明PM2.5染毒可以誘導(dǎo)ROS形成,可能進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡或者死亡等。MDA是人體膜脂過氧化最為重要的產(chǎn)物之一,MDA的產(chǎn)生可以加劇細(xì)胞膜的損傷,因此MDA在毒性細(xì)胞研究中最為常見的指標(biāo),可以通過MDA的表達(dá)水平了解脂質(zhì)過氧化程度,進(jìn)而測(cè)定膜受損程度等[11],本結(jié)果顯示MDA表達(dá)水平隨著PM2.5濃度的增加逐漸升高,并且在300、400 μg/ml升高更加明顯,說明PM2.5染毒誘發(fā)了脂質(zhì)過氧化反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,同樣也有研究顯高水平的MDA會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的聚合,具有明顯細(xì)胞毒性,也有研究發(fā)現(xiàn)MDA影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及關(guān)鍵酶作用,同樣反應(yīng)脂質(zhì)過氧化程度,間接反應(yīng)機(jī)體受自由基的損傷程度等。LDH是一種糖酵解酶,可以催化乳酸生成丙酮酸,存在組織細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),正常情況下不能透過細(xì)胞膜,如果細(xì)胞膜受到損傷或者破裂,LDH就會(huì)漏出,因此通過檢測(cè)LDH漏出量間接反應(yīng)細(xì)胞受損傷程度[12],本研究結(jié)果為HUVEC細(xì)胞LDH漏出量隨著PM2.5濃度升高逐漸升高,存在明顯劑量反應(yīng)關(guān)系,說明PM2.5染毒后細(xì)胞膜通透性可能增加或者細(xì)胞張力降低,這是細(xì)胞趨向凋亡的過程,因此也反應(yīng)可能在細(xì)胞凋亡中過程起著一定作用。

細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞基因控制的程序化死亡,是細(xì)胞為了適應(yīng)生存環(huán)境而自身調(diào)節(jié)死亡過程,外界因素通過各種途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡調(diào)控異常就會(huì)引起疾病的發(fā)生[13]。大量文獻(xiàn)研究顯示毒物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡線粒體依賴途徑起著主要作用,本文通過采流式細(xì)胞儀檢測(cè)染毒后細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示隨著PM2.5染毒劑量增加,細(xì)胞早期凋亡率、中晚期凋亡率以及死亡細(xì)胞率等均具有上升趨勢(shì),其中細(xì)胞早期凋亡率變化最為明顯,說明細(xì)胞早期對(duì)于PM2.5毒性最為敏感,同時(shí)反應(yīng)對(duì)細(xì)胞損傷程度,在PM2.5濃度為300 μg/ml細(xì)胞凋亡率大約在65.96%,說明高濃度的PM2.5可以誘發(fā)細(xì)胞大部分凋亡,細(xì)胞過度凋亡可能是某些疾病始發(fā)病因,比如動(dòng)脈粥樣硬化,因此認(rèn)為PM2.5可能是誘發(fā)或者促進(jìn)疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

綜上所述,PM2.5染毒對(duì)HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的毒性作用,并且隨著濃度升高毒性增強(qiáng),對(duì)細(xì)胞損傷增大,并且可能促進(jìn)細(xì)胞凋亡率升高。