miR-195-5p靶向PAPPA對肺癌A549細胞增殖、遷移的影響及分子機制

楊華軍 何仕瓊 李小平 林江 杜飛 簡悅

(1遵義市第一人民醫院(遵義醫科大學第三附屬醫院)呼吸與危重癥醫學科,貴州 遵義 563002;2興義市人民醫院(貴州醫科大學附屬興義醫院))

肺癌是起源于肺實質或氣道的惡性腫瘤,是癌癥死亡的首要原因〔1〕。因早期診斷困難,大多數患者出現疑似肺癌的癥狀或偶然發現胸部影像學異常而進行診斷性評估,確診時已喪失最佳治療機會,預后較差。肺癌轉移是病情惡化的主要原因,但轉移及擴散的分子機制尚不明確。研究表明,miRNA參與腫瘤的發生、發展及分化,在腫瘤的增殖和轉移中發揮重要作用〔2〕。miR-195-5p在甲狀腺癌中具有調節細胞增殖、凋亡和侵襲的作用〔3〕,在骨肉瘤中,環狀RNA Circ001422通過miR-195-5p/成纖維細胞生長因子(FGF)2/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)軸導致病情惡化〔4〕。妊娠相關血清蛋白(PAPP)A與細胞生長、分化密切相關,并參與腫瘤形成。靶基因預測其可能是miR-195-5p的靶基因,但miR-195-5p與PAPPA在肺癌中的研究還未見報道,本研究探討miR-195-5p靶向PAPPA對肺癌A549細胞增殖、侵襲和遷移的影響及分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 人肺腺癌細胞A549、人支氣管黏膜上皮細胞BEAS-2B(中國科學院上海細胞庫);Lipo-fectamine 3000(美國Invitrogen公司);miR-NC、miR-195-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-195-5p(上海生工生物工程有限公司);si-NC、si-PAPPA(美國San-ta Cruz公司);對照質粒(pcDNA)、過表達質粒(pcDNA-PAPPA)、野生型(WT)及突變型(MUT)PAPPA基因3′UTR熒光素酶表達載體(上海漢恒生物科技有限公司);實時熒光量定-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)、SYBR Green熒光染料試劑盒(大連TaKaRa公司);胎牛血清、RPMI1640培養基(泰思騰生物技術有限公司);CCK-8試劑盒、PAPPA抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG二抗、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒(武漢三鷹生物技術有限公司)。

1.2細胞轉染及分組 采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基和F12培養基分別培養人肺腺癌A549細胞和人支氣管黏膜上皮細胞BEAS-2B。將細胞按1×105個/孔接種24孔板,培養至融合度為50%時,更換為不含血清的培養基繼續培養12 h后再進行轉染。miR-NC組與miR-195-5p組通過Lipofectamine3000分別將miR-NC質粒和miR-195-5p mimics轉染至A549細胞,轉染6 h后更換為常規RPMI1640培養基,繼續培養1、2、3、4 d,收集對數生長期細胞檢測細胞增殖。si-NC組、si-PAPPA組分別轉染si-NC質粒與si-PAPPA質粒至A549細胞,轉染及處理方法同上。為證實miR-195-5p是靶向PAPPA調控A549細胞增殖及凋亡,將miR-195-5p mimics分別與pcDNA及pcDNA-PAPPA共同轉染至A549細胞,檢測PAPPA能否逆轉miR-195-5p促進凋亡及抑制增殖的生物學作用,后續實驗分為miR-195-5p+pcDNA組、miR-195-5p+pcDNA-PAPPA組,轉染方法同上。

1.3總RNA提取 槍頭、EP管均去酶處理,Trizol法提取各組細胞總RNA。取2 μl RNA樣品于紫外分光光度計上測定純度及濃度。

1.4qRT-PCR 用qRT-PCR試劑盒檢測miRNA相對含量。按說明書步驟進行操作,用基因特異性RT引物(U6:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAATA-3′;miR-195-5p:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG CACTGGATACGACGCCAATAT-3′)及通用型逆轉錄引物oligo dT prime將500 ng總RNA逆轉錄成cDNA。DEPC水將反轉錄所得的cDNA稀釋5倍,采用特異性引物(β-actin上游引物:5′-CCACATAGGAATCCTTCTGACC-3′,下游:5′-CTTCGCGG-GCG ACGAT-3′;PAPPA上游引物:5′-ACAAA-GACCCACGCTACTTTTT-3′,下游:5′-CATGAACTGCCC ATCATAGGTG-3′;miR-195-5p上游引物:5′-GATAGCAGCACAGAAATATTGGG-3′,下游:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;U6上游引物:5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′,下游:5′-AGAG-AAGATTAGCATGGCCCCTG-3′)進行PCR,20 μl體系(PCR條件:95 ℃熱啟動3 min,95 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 10 s,40個循環),每孔均設2個復孔,采用2-ΔΔCt分析各組miRNA相對含量。

1.5CCK-8檢測細胞增殖活力 調整細胞濃度為1×104個/ml,以100 μl/孔接種于96孔板,空白孔加入100 μl完全培養基,每組設置3個復孔進行常規培養。分別在鋪板后1、2、3、4 d取出培養板,吸出培養基,每孔加入含10% CCK-8試劑的完全培養基100 μl,置于培養箱中繼續孵育2 h;再取出培養板在酶標儀450 nm波長處檢測吸光度OD值。

1.6Transwell實驗 用無血清培養液重懸各組細胞,基質膠平鋪覆蓋Transwell上室,取200 μl接種并培養24 h,棄去培養液,用4%多聚甲醛固定30 min,再加入結晶紫染色,漂洗干燥后用顯微鏡拍照并計數,即為侵襲細胞數。

1.7劃痕實驗 用標記筆在6孔板背后每隔0.5～1.0 cm劃一道橫線,從中間橫穿過孔,每孔至少穿過5條線,在孔中加入約5×105個細胞,37 ℃、5%CO2培養箱培養,第2天用10 μl槍頭比著直尺,與標記線垂直的方向劃兩條平行線。用磷酸鹽緩沖液(PBS)將細胞洗滌3次,吸出劃下的細胞,再加入無血清培養基,放入37 ℃、5%CO2培養箱,分別在0、6、12、24 h倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.8Western印跡 收集各組細胞加入RIPA蛋白裂解液,提取細胞總蛋白并用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度,各組蛋白(樣品量60 μg)進行凝膠電泳,再轉膜封閉,90 min后加入PAPPA(1∶500)蛋白一抗,用Tis-HCl緩沖液(TBST)洗滌后再加入二抗(1∶1 000),室溫孵育2 h,TBST緩沖液反復沖洗3次,每次10 min,然后顯影,置于凝膠成像系統觀察各條帶并用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.9統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1miR-195-5p和PAPPA在肺癌A549細胞中的表達 miR-195-5p在肺癌A549細胞中的表達較BES-2B明顯降低,而PAPPA在肺癌A549細胞中表達明顯增高,PAPPA蛋白在肺癌A549細胞中的表達也明顯增高(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 PAPPA蛋白在肺癌A549細胞中的表達

表1 miR-195-5p、PAPPA mRNA及蛋白相對表達量在肺癌A549細胞中的表達

2.2過表達miR-195-5p對A549細胞增殖、侵襲和遷移的影響 miR-195-5p組24、48、72、96 h細胞增殖能力顯著低于miR-NC組(P<0.05);miR-195-5p組A549細胞侵襲及遷移個數顯著低于miR-NC組(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 過表達miR-195-5p對A549細胞侵襲及遷移的影響(結晶紫染色,×100)

表2 過表達miR-195-5p對A549細胞增殖侵襲、遷移的影響

2.3沉默PAPPA對A549細胞增殖、侵襲和遷移的影響 沉默PAPPA后A549細胞增殖、侵襲、遷移能力均顯著低于si-NC組(均P<0.05)。見表3。

表3 抑制PAPPA對A549細胞增殖、侵襲及遷移的影響

2.4miR-195-5p靶向調控PAPPA表達 通過targetscan網站預測,miR-195-5p在靶基因PAPPA的3′UTR第833-840、848-854個堿基序列上具有相應的結合位點(圖3)。轉染WT-PAPPA,再轉染miR-195-5p mimics后A549細胞的熒光素酶活性(0.71±0.06)較miR-NC組(1.00±0.04)明顯降低(t=6.96,P=0.002);轉染MUT-PAPPA后再轉染miR-195-5p mimics,A549細胞的熒光素酶活性(0.99±0.03)較miR-NC組(1.01±0.03)無明顯變化(t=0.82,P=0.460)。miR-195-5p組A549細胞中PAPPA蛋白表達(0.42±0.05)較miR-NC組(1.02±0.04)明顯降低(t=-16.32,P<0.05),轉染anti-miR-195-5p后A549細胞中PAPPA蛋白表達(1.11±0.05)明顯高于anti-NC組(0.99±0.04;t=-3.24,P=0.030)。見圖4。

圖3 PAPPA的3′UTR中含有與miR-195-5p互補的核苷酸序列

圖4 各組PAPPA蛋白表達

2.5過表達PAPPA逆轉了miR-195-5p對A549細胞的增殖、侵襲和遷移作用 miR-195-5p+pcDNA-PAPPA組A549細胞的增殖活性較miR-195-5p+pcDNA組明顯增強(P<0.05),侵襲及遷移能力明顯增加(P<0.05)。見表4。

表4 過表達PAPPA能逆轉miR-195-5p對A549細胞增殖、侵襲及遷移的影響

3 討 論

肺癌因發病率高、遠處轉移早,早期診斷困難,很多病例確診時已經處于中晚期,導致臨床治療效果不理想,亟待尋找新的治療方法。癌癥擴散轉移是病情惡化及預后不良的標志,也是治療失敗和臨床死亡的首要原因。因此,肺癌轉移的分子機制逐漸成為研究熱點。研究表明,miRNA影響癌細胞的侵襲和轉移,通過調控下游靶基因表達從而影響疾病轉化〔5〕。本研究結果提示,miR-195-5p具有調控肺癌A549細胞生物學行為的作用,miR-195-5p表達水平降低可能是非小細胞肺癌的潛在危險因素,可作為肺癌預后判斷的潛在生物標志物〔6〕。

A549細胞中PAPPA表達水平明顯升高,通過RNA干擾技術降低PAPPA的表達來證實PAPPA的生物學作用,本研究結果說明,抑制PAPPA與過表達miR-195-5p對A549細胞增殖、侵襲及遷移的作用相似,miR-195-5p對PAPPA具有負向調控作用。PAPPA通過誘導肺癌細胞增殖、促進侵襲和遷移從而導致肺癌細胞倍增及遠處轉移。本研究結果進一步證實,miR-195-5p靶向調節PAPPA,抑制其表達。既往研究表明,PAPPA是一種新的間質分泌因子,PAPPA高表達與晚期肝癌密切相關,提示預后不良〔7〕,miR-599/PAPPA軸還能減弱氧化低密度脂蛋白誘導的血管平滑肌細胞增殖、遷移和侵襲〔8〕。與上述報道相似,本研究結果提示,PAPPA在肺癌中高表達,并具有促進A549細胞增殖、侵襲和遷移等生物學作用,而癌癥轉移與細胞增殖、侵襲及遷移密切相關〔9〕,是腫瘤預后較差的獨立危險因素〔10〕。Targetscan軟件預測結果暗示PAPPA與miR-195-5p存在調控關系和結合位點,本研究證實了在肺癌中miR-195-5p和PAPPA之間的調控關系。

綜上,miR-195-5p在肺癌中表達下調,過表達miR-195-5p通過抑制PAPPA的表達從而抑制肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移。